Введение к работе
Актуальность проблемы.
Вопрос о существовании структурно-функциональных доменов в геноме эукариот обсуждается уже в течение 30 лет. В настоящее время считается общепризнанным;, что существует несколько уровней конпоктиэации хроматина в клетке. Одним из высших уровней структурной организации хроматина является его укладка в квазиэапкнутые петли ДНК размеров от 30 до 200 тысяч пар нуклеотидов, закрепленные на ядерной матриксе. Неоднократно" высказывалось предположение о вероятной соответствии хромосомных петель ДНК. функциональным доменам генома, таким как транскриптоны, репликоны, рекомбинаны (термин введенный впервые Филипскин Я. и Светловой Е.В.). Однако, многочисленные попытки проверить эту гипотезу экспериментальным путем привели к противоречивым результатам. Одной из причин этого являлась отсутствие надежного метода картирования границ петель ДНК. В качестве возможных кандидатов на роль границ петель предлагались SRR/tlflR-элементы, инсуляторы, легкоплавкие последовательности. Но ни один из этих элементов не был найден во всех пограничных районах транскрипционно-активмых доменов хроматина. Изучение доменной организации генома осложняется динамичность .этой организации в процессе развития и дифференцирования (зародыаевые и тканеспециФические клетки, метилирование) и в течение клеточного цикла (организация в хромосомы, в пєтофозє -репликации хронатина и экспрессия генов в иктбрваае). В этой связи не вызывает сомнения необходимость разработки новых подходов для характеристики специфичности организации хромосомной ДНК в петли, что и явилось целью настоящей работы.
Цели и задачи работа,
Целью данной работы явилось изучение базисных принципов, по который происходит укладка хронатиковой Фибриллы в хромосомы в ядре эукариотической клетки, используя в качестве экспериментальной надели
2 искусственные хромосомы дрожжей. Нами были поставлены следующие экспериментальные задачи:
1 . исследовать возможность использования искусственных хромосом дрожжей (VRC), имеющих протяженные участки ДНК человека, в качестве модели для изучения Физико-химических и биохимических свойств Фрагментов ДНК человека, претендующих на роль границ петель или доменов.
2. сравнить характер организации ДНК в доменную
структуру в искусственной хромосоме дрожжей, имеющей в
своем составе последовательности ДНК человека, со
структурой доменов в человеческих клетках на участке ДНК с
уже известным нуклеотидным' составом и свойствами."Для этой
цели предполагалось использование искусственной хромосомы
дрожжей, несуцей кластер |}-г лобиновых генов человека.
3. провести крупномасштабное картирование CG-боготых
участков ДНК и сравнить характер их распределения с
распредлением гиперчувствительных к нуклеазам сайтов и
сайтов, по которым происходит фрагментирование ДНК
эндогенной топоизомеразой II, в хроматине искусственных
хромосом дрожжей.
Научная новизна и практическое значение работы.
В настоящей работе впервые показана возможность использования искусственных хромосом дрожжей (VflC) в качестве модели для изучения доменной организации хроматина высших эукариот.
Продемонстрирована значительная корреляция позиций гиперчувствительных к нуклеазам сайтов и CG-богатых участков.
Сделано предположение о мозаичном расположении в геноме рекомбинонов (термин, введенный в этой работе) и о том, что ' идиосинкратичные сайты (термин, введенный в этой работе впервые для обозначения сайтов, в которых преимущественно происходит Фрагментирование хроматина нуклеазами и расцепление ДКК рсстрих.тааами) являются предпочтительными участками рекомбинации.
Предложена оригинальная модель структуры границ доменов хроматина.
Обнаружение идиосинкратичных сайтов позволит конструировать трансгенные клетки с больней эффективностью (встраивание в геном Чужеродных последовательностей ДНК будет проводиться по "горячим" точкам рекомбинации) .
Полученные данные являются основой для дальнейшего изучения механизмов организации ДНК в доменные структуры, а .также представляют определенный интерес в исследованиях, связанных с изучением рекомбинации.
Япробацмя работы.
Работа была апробирована на FE8S Lecture Course (Греция, 1995), на симпозиуме "Progress in Tumor Biology" (Польша, 1995) и Hq конференции "Structure and Function of DHfl: ft Physical Hpproach" (Франция, 1996).
Публикации,
По материалам диссертации опубликовано 3 научные работы.
Объеп и структура диссертации.
Диссертация изложена на ч"|(/ страницах машинописного
текста и состоит из следующих частей: введение, обзор
литературы, материалы >и методы исследований, результаты,
обсуждение, выводы, заключение и список литературы.
Библиография включает' 216 источников. Работа
проиллюстрирована 20 рисунками и 1 таблицей.