Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние годы установлен феномен повышенной нестабильности определенных семейств . геномных элементов, хромосомных локусов и доменов, выявление полиморфизма которых является одним из центральных вопросов при исследовании молекулярно-генетичоских механизмов наследственных заболеваний. С другой стороны, выделение гипервариабельных локусов позволяет использовать их в качест'ве высокоинформативных марке_ров при картировании генома, анализе сцепления с дефектными генами при наследственных заболеваниях и при гонотипировании личности.
Дополнительные возможности в исследовании высокополиморфных маркеров ДНК открылись с разработкой в 1985 году метода амплификации ДНК на основе полимеразной цепной реакции (ПИР). Этот метод обладает рядом достоинств, к числу которых' прежде всего относятся быстрота проведения эксперимента и возможность использования крайне малых количеств ДІЖ. Он позволяет проводить быстрое картирование генома и конструирование карт сцепления. Гипервариабельные локусы, содержащие тандемные повторы с изменяющимся числом копий (в дальнейшем - тандемные повторы) являются с этой точки 'зрения наиболее перспективным типом полиаллелыгаго полиморфизма. Исследование их полиморфизма методом амплификации ДНК дает также возможность решить крайне важные практические задачи постановлению родства, определению отцовства и материнства,' индивидуальной идентификации и мониторингу трансплантантов костного мозга.
Цель работы. В настоящем исследовании сделана попытка применить метод амплификации ДНК на основе ПЦР для типирования локусов генома человека с мультиаллельным полиморфизмом, обусловленішм точечными заменами нуклеотидов в гене hla-dqai и тандемными повторами в гипервариабельных локусах человека. Параллельно решалась задача по разработке надежного метода определения пола на основе амплификации повторяющихся последовательностей ДНК, расположенных на половых хромосомах, который позволил бы проводить быструю пренатальную диагностику * пола. Необходимо было определить частоты встречаемости аллелей и генотипов rtiia hla-dqai и гипервариабелышх локусов аров, D17S5,
IGHJ, D1S80 в двух восточнославянских популяциях (русская города Москвы и белорусская) и показать их соответствие закону Харди-Вайнберга. Полученные данные необходимы для создания системы семейного анализа с цолыэ определения отцовства и материнства и комплексной системы биологической идентификации личности на основе амплификации ДІЖ.
Научная новизна и практическая ценность работы. Настоящая работа является частью комплексных исследований полиморфизма ДНК и генотипирования личности, проводимых лабораторией молекулярной диагности и геномной дактилоскопии ВНИИ генетика. До настоящего времени отсутствуют данные по популяционным исследованиям частот встречаемости аллелей и генотипов исследованных локусов в славянских популяциях, что заметно усложняет семейный анализ и проведение генотипирования личности в России. Наші впервые проведен анализ полиморфизма гена hla-dqai и четырех гипервариабельных -локусов в восточнославянских популяциях и доказана их генетическая однородность. Метод анализа полиморфизма локусов с тавдемными повторами впервые предложен нами для семейного анализа с целью решения проблемы спорного отцовстеэ. В целом предложена система комплексной биологической идентификации человека на основе метода амплификации ДНК, которая включает определение? 1) половой принадлежности; 2) типирование аллелыю'го (точечного) полиморфизма гена hla-dqai; 3) типирование полиморфизма повторяющихся последовательностей. Разработанная нами система, включающая также оптимизацию методов выделения и очистки ДНК, применима при исследовании предрасположенности к аутоиммунным заболеваниям, для правильного подбора пар донор-реципиент в трансплантологии, при исследовании динамики популяций.
Апробация работы.' Материалы, диссертации' докладывались на семинаре лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии ВНИИ генетика (1993 г.), 23-й и 24-й Конференциях Европейского общества генетики человека (Бельгия, 1991 г. и Дания, 1992 г.), Конференции "Синтетические олигонуклеотиды: проблемы и перспективы практического использования"" (Москва, 1S91 г.). Второй международной конференции по фингерпринтингу ДНК (Бразилия, 1992 г.).
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на ... страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы.