Введение к работе
Актуальность темы. Изучение внеклеточных микробных рибонуклеаз (РНКаз), катализирующих деградацию РНК, представляет собой интерес преимущественно с научной точки зрения. Наиболее і изучеішой группой среди отих ферментов является семейство микробных РНКаз, объединяющее низкомолекулярные циклизующие РНКазы, секретируемые некоторыми видами грибов, стрептомицетов и бацилл [КФ 3.1.4.23]. Несмотря на таксономсгрическую удалёшюсть этих организмов, РНКазы семейства имеют области структурной гомологии, находящиеся в районе активного центра фермента и субстрат — связывающего участка т.е. в функционально значимых участках РНКаз (Sevcik J., et al., 1990, TIBS, v.15(4), pp.158-162)
Белки, представители семейства микробных РНКаз, являются удобным и широко используемым модельным объектом структурно — функциональных исследований, включающих в себя проблеммы сворачивания полипептидов и проблемы структурных основ биологической специфичности.
Как правило, проведение подобного рода исследований включает в себя не только исследование физико — химических свойств белка дикого типа, но и работы по изменению структуры этого белка (сайт—специфический мутагенез и/или химическая модификация). Подобного рода исследования требуют значительных количеств высокоочищенных белков как дикого, так и мутантого типа. Использование для этих целей природных продуцентов ферментов зачастую ограничено низким уровнем экспрессии целевого белка, а так же сложностью (и дороговизной ) работ по сайт — специфическому мутагенезу в грибах, стрептомицетах и бациллах.
Цель работы. Целью настоящей работы являлось: разработка
высокоэффективной экспрессионной системы, пригодной для
клонирования и . экспрессии рибонуклеазы из Bacillus
amiloliquefaciences, (РНКаза барназа, Ва), рибонуклеазы из Bacillus
intcrmedius (РНКаза бтіаза, Ві) и их мутшпгіьгх форм, создание
эффективной схемы очистки этих рибоїгуклеаз и их мутантов,
получение ряда мутантных форм рибонуклеаз барназы и биназы в
области, ответственной за связывание субстрата, и изучение
основных каталитических свойств этих мутантных белков.
Научная новизпа работы. Разработана высокоэффективная система
для экспрессии РНКаз барназы и биназы в Я. coli, основанная на
использовании сильного, хорошо регулируемого промотора Рг
фага X под контролем термочувствительного ропрессора cls57. Для
ряда бациллярігьк внеклеточных рибоїгуклеаз обнаружен эффект
зависимости количества белка, элюирующегося с обращение—
. фазового сорбента, от рН подвижной фазы. Предложена
гипотеза, объясняющая невдошшй эффект, и получено
экспериментальное подтверждение этой гипотезы. Разработана 2-х стадийная схема очистки внеклеточных бациллярішх РНКаз и их мутантных производных, базирующаяся на их свойствах в условиях Оф—ВЭЖХ. Получены мутантные производные барназы и биназы в области "узнающей петли". Изучены их каталитические свойства в реакциях гидролиза пуриновьгх гомополирибонуклеотидов.
Показало, что замена "узнающей петли" гуанилпрсдпочтителыюй
РНКазы ВІ на "узнающую петлю" гуанилснецифичной РНКазы
Sa не приводит к полному изменению гуанилспецифичности
мутантного белка в реакциях гидролиза го.мополирибонуклеогндов.
Практическая ценность работы. Сконструированная
высокоэффективная система для экспрессии генов РНКаз барназы и бииазы в Е. coli позволяет получать целевой белок в значительных количествах, что существенно облегчает проведение различных структурно — фнкциональных исследований. Разработанный двух — стадшіньш метод очистки исследуемых белков позволяет получать гомогенный препарат белка с высоким выходом.
Апробация. Основные положения диссертационной работы были представлены на Международной конференции "Современная энзимология: проблемы и перспетивы" (Санкт — Петербург, 1992), па 3—ей Международной конференции "Рибонуклеазы: Химия, биология, биотехнология" (Capri, Italy, 1993) И на конференции Научного общества Нидерландов (Lunteren, The Netherlands, 1993). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей, список которых приведен в конце автореферата.
Структура и объём работы. Диссертационная работа состоит из
введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей
главы "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", выводов и
списка -цитируемой литературы, включающего наименований.
Работа изложена на 150 страницах, включает 26 рисунков и 22 таблицы.