Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1.1 Введение 7
1.2 Прионы млекопитающих 8
1.2.1 Прионы - новый класс инфекционных агентов 8
1.2.2 Инфекционная активность прионов млекопитающих связана с белком PrPSc 11
1.2.3 Молекулярные модели прионного превращения 11
1.3 Прионы низших эукариот 14
1.3.1 Ыехромосомные детерминанты [РБГ], [URE3] и [PIN*] дрожжей 14
1.3.2 Цитопл аз мати ческий детерминант [Het-s] гриба Podospora anserina 19
1.4 Молекулярная природа детерминанта [pst]\ прионные свойства белка SUP35 20
1.4.1 Структура и функция белка Sup35 20
1.4.2 Экспериментальные доказательства прионных свойств белка Sup35 23
1.4.3 Возможность существования [РЗҐ] у других организмов 26
1.4.4 Амилоиды млекопитающих, их сходство с прионными белками дрожжей Sup35iiUre2 27
1.4.5 Амилоидные белки с экспансией полиглутамина, болезнь Хантингтона 28
1.5 Роль шаперонов в поддержании прионного состояния белков 31
1.5.1 Краткий обзор клеточных шаперонов 31
1.5.2 Роль шаперона Hspl04 в поддержании детерминанта [Р5Ґ"] и других прионов 33
1.5.3 Рост клеток на среде с GuHCl приводит к потере прионного фенотипа 34
1.6 Распространённость прионов в природе 35
1.6.1 Биологическое значение прионов 37
1.7 Перспективы лечения прионных заболеваний 42
1.8 Заключение 43
2. Цели и задачи 45
3. Материалы и методы 46
3.1 Штаммы микроорганизмов и генетические методы 46
3.1.1 Штаммы дрожжей 46
3.1.2 Штаммы бактерий 46
3.1.3 Культура клеток человека 46
3.2 Среды и условия культивирования микроорганизмов 46
3.2.1 Среды для выращивания Е. соМ 46
3.2.2 Среды для выращивания S. cerevisiae 47
3.3 Трансформация микроорганизмов 47
3.4 Генетические методы 49
3.4.1 Генетическая система для детекции прнонных фенотипов 49
3.5 Конструирование гошмидных днк 50
3.6 Биохимические методы 52
3.6.1 Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli 52
3.6.2 Приготовление дрожжевых лизатов 53
3.6.3 Метод полуденатурирующего агарозиого электрофореза (SDD AGE) 54
3.6.3 Фракционирование дрожжевых лизатов 56
3.6.4 Электрофорез в ПААГ и иммуноблоттинг 56
4. Результаты 57
4.1 Анализ структурных свойств прионных агрегатов белка sup35 методом полуднатурирующего электрофореза 57
4.1.1 В клетках [Р57*] прионные агрегаты состоят из полимеров белка Sup35 57
4.1.2 Уменьшение уровня Hspl04 приводит к увеличению размера приопных полимеров из-за блокирования фрагментации 63
4.1.3 GuHCl блокирует фрагментацию полимеров белка Sup35 65
4.1.4 Сверхэкспрессия Hspl04 приводит к увеличению размера полимеров белка Sup35 67
4.2 Анализ агрегатов различных прионоподобных белков 69
4.2.1 Прионоподобные агрегаты белков Rnql, Sup35PS, Publ и Q103 состоят из SDS-устойчивых полимеров 69
4.3 Анализ искусственных прионов, сконструированных на основе голиглутамина, и их сравнение с SUP35 71
4.3.1 Прионоподобные характеристики Q70, Q85 и QY76 73
4.3.2 Размер прионных полимеров белков Q70 и QY76 зависит от активности шаперона Hspl04 75
4.3.3 Присутствие GuHCI в среде приводит к увеличению размера прионных полимеров белков Q70 и QY76 77
4.3.4 Сверхпродукция шаперона Hspl04 приводит к увеличению размера прионных полимеров белков Q70, Q85 и QY76 78
5. Обсуждение 81
5.1 Структурная организация прионов 81
5.2 Паперон hsp104 осуществляет фрагментацию прионных полимеров белка sup35 82
5.3 Разработанный метод электрофоретического анализа полимеров применим для исследования различных амилоидогенных белков 85
5.4 Белки с полиглутаминовыми последовательностями образуют прионоподобные полимеры в клетках дрожжей 87
5.5 Полимеры qy76 фрагментируются с помощью hsp104 87
5.6 Полимеры qy76 могут фрагметироваться независимо othsp104 88
5.7 Полиглутаминовые полимеры фрагментируются с помощью hsp104 89
5.8 Сходства и отличия свойств полимеров, образованных sup35hbemamh polyq/qy 90
5.9 Заключение 92
Выводы 93
- Прионы млекопитающих
- Роль шаперонов в поддержании прионного состояния белков
- Среды и условия культивирования микроорганизмов
- Анализ искусственных прионов, сконструированных на основе голиглутамина, и их сравнение с SUP35
Введение к работе
Открытие феномена пионов позволило обнаружить существование нового типа наследственности на основе белка. Термин "прион" появился в связи с исследованием ряда заболеваний с неизвестной этиологией, таких как скрэйпи овец и болезнь Крейцфельда-Якоба у человека. Несмотря на то, что эти болезни известны довольно давно, природа их оставалась загадкой достаточно долго. Объяснение столь медленного хода исследований заключалось в необычном способе возникновения этих болезней: они могут возникать спонтанно и в то же время могут наследоваться, а также передаваться инфекционным путем. Долгое время комбинация этих трех свойств казалась необъяснимой. В 1967 была предложена так называемая "белковая" гипотеза, согласно которой инфекционный агент, вызывающий эти заболевания, позже получивший название "прион", представляет собой обычный клеточный белок, принявший особое конформадионное состояние. Это состояние способно само поддерживаться за счет автокаталитического механизма. На сегодняшний день эту гипотезу можно считать доказанной. Ее подтверждают практически все экспериментальные данные, а таюке тот факт, что до сих пор не удалось найти какую-либо нуклеиновую кислоту, связанную с этими инфекционными заболеваниями.
За последние десять лет появились работы, показывающие существование прионоподобные белков у дрожжей Saccharomyces cerevisiae и гриба Podospora anserino. Если у млекопитающих существование прионов связано с патологией, то у низших эукариот наследуемое переключение активности белков, вызванное их переходом в прионное состояние, может иметь адаптивное значение, У дрожжей прионоподобные свойства белков лежат в основе механизмов эпигенетической наследственности и регуляции экспрессии генов на посттрансляционном уровне. Изучение прионов у дрожжей открывает новые перспективы в понимании сущности этого явления в целом. Феномен прионов относится к типу, так называемых, амилоидных белков, образующих фибриллярные агрегаты со специфической белковой укладкой. Похоже, что феномен прионов и амилоидов гораздо шире распространен в природе и играет существенно более важную роль у различных организмов, чем это предполагается на сегодняшний день. Поиск в банках генов выявляет значительное количество белков у различных организмов, структурно сходных с уже известными прионными белками у дрожжей, Это позволяет полагать, что белки, которые могут изменять свою конформацию и полимеризоваться, широко распространены и могут играть важную роль во внутриклеточной регуляции. Кроме того, до сих пор остается открытой проблема диагностики и лечения прионных болезней у человека и животных. Особое значение данная проблема получила в силу появившихся в последнее время сообщений о возможности передачи этих заболеваний от животных к человеку (при употреблении больных животных в пищу). Также, сходство свойств дрожжевых прионов и амилоидов млекопитающих выводит актуальность исследований в этой области на передний план.
Прионы млекопитающих
Прионы - это инфекционные агенты белковой природы. У человека и животных они вызывают неизлечимые нейродегенеративные заболевания. Наиболее известные из подобных заболеваний человека - это болезнь Крейцфельда-Якоба (БКЯ) и синдром Герстмана-Штраусслера-Шейнкера (ГШШ), а у животных - скрэйпи овец и губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота, называемая часто в средствах массовой информации коровьим бешенством. Эти заболевания сопровождаются морфологическими изменениями тканей мозга и появлением в них амилоидных бляшек, содержащих фибриллярные нерастворимые белковые агрегаты, которые и представляют собой инфекционное начало. Это придает им сходство с так называемыми амилоидными нейродегенеративными заболеваниями (болезни Альцгеймера, Паркинсона, Хантингтона и др.), в которых также происходит образование подобных структур, но которые не являются инфекционными. Необходимо добавить, что почти все заболевания такого рода на данный момент неизлечимы и являются смертельными для человека. В шестидесятых годах, в основном в работах Гайдушека (Gajdusek etal.,1966), удостоеных в 1976 году Нобелевской премии, была показана инфекционная природа прионных заболеваний, Инфекционность прионных болезней в человеческой популяции была продемонстрирована на примере эпидемии куру. Эта болезнь развивалась у аборигенов Новой Гвинеи и была связана с ритуальным каннибализмом. Островитяне поедали мозг умерших родственников в знак уважения к ним. С прекращением этого обычая исчезла и эпидемия. В дальнейшем было показано, что ткань мозга людей, умерших от данной болезни, содержала инфекционное начало, способное заразить человекообразных обезьян (Gajdusek et al., 1966). Эти и подобные им исследования позволили выделить новый класс инфекционных нейродегенеративных заболеваний человека и животных, Уникальная особенность описанных выше заболеваний состоит в том, что они могут возникать не только в результате инфекции: известны спорадические и наследственные формы болезней; причем независимо от происхождения заболевания оно может быть передано инфекционным путем. В 1967 году математик Гриффит (Griffith, 1967) высказал предположение о том, что инфекционный агент имеет необычную природу - не содержит никакого генетического материала, а представляет собой особую, измененную форму одного из клеточных белков, способную воспроизводить свои свойства за счет автокаталитического механизма.
Последующие труды Стенли Прузинера (Pmsiner) и других исследователей доказали справедливость этой гипотезы, и в 1997 году Прузииер получил Нобелевскую премию в области физиологии и медицины за "открытие прионов - нового биологического принципа инфекций". В 1982 году ему удалось выделить инфекционный агент скрэйпи и показать его белковую природу. При этом инфекционность была устойчивой к обработке нуклеазой, различными мутагенами ДНК и ультрафиолетовому облучению. Однако, она инактивировалась протеиназой К, мочевиной и другими хаотропными агентами, нарушающими структуру белков (Pmsiner et al, 1982). Прузинер назвал этот агент прионом (proteinaceous infectious particle), а белок - PrP (Prion Protein), Очистка белка PrP позволила идентифицировать ген Ргпр, кодирующий этот белок (Oesch et.al. 1985). Было показано, что этот ген присутствует в геноме всех видов млекопитающих, а также у птиц. Нормальный PrP(PrP ) оказался мембранным белком, экспрессирующимся независимо от прионной инфекции. Его функция не вполне ясна, хотя известно, что он принимает некоторое участие в метаболизме меди (Brown et.al, 1999), а также является маркером стволовых клеток и участвует в их обновления (Zhang et.al, 2006). Белок РгРс имеет молекулярную массу 33-35 кДа. Он полностью деградирует при обработке протеиназой К. В инфекционном материале была обнаружена альтернативная форма этого белка - PrPSc (от английского scrapie) идентичного размера, при обработке протеиназой К он превращался в белок с молекулярной массой 27-30 кДа(Ршзтег et al, 1982), в котором отсутствовали бб N-концевых аминокислот. Кроме того, PrPSc отличался от РгРс плохой растворимостью в детергентах и склонностью к агрегации (Prusiner et al, 1983; Oescli et a/.; 1985). Прионная изоформа белка PrP отличается от нормальной только конформацией этого белка. Более детальное исследование показало, что эти конформации различаются уже на уровне вторичной структуры. Так, белок PrPSt имеет в основном (З-складчатую структуру (50% рьслоев и 20% а-спиралеи), в то время как в состоянии iYc этот белок обогащен а-спиральными участками (40% а-спиралей) и практически не содержит (3-слоев (Pan et al, 1993). Таким образом, было установлено, что данный" белок может переходить из одной коиформационной формы в другую. При этом прионная (патогенная) форма белка PrPSe стимулирует конформационный переход из РгРс в PrPSc, что и обуславливает инфекционность прионного белка. В последствии прионная гипотеза была доказана. Согласно этой модели прионное состояние присуще мономеру РгР, а конформационное превращение молекулы РгРс в PrP scпроисходит во время ее связывания с мономером PrPSc. Сразу после превращения димер диссоциирует, освободившиеся молекулы PrP Sc участвуют в новых актах превращения. При этом агрегация РгР L рассматривается как вторичное явление, не связанное с прионным переходом. Можно заметить, что эти две модели не являются взаимоисключающими. Поэтому, возможен, в принципе, некоторый гибридный механизм прионного превращения, когда белок взаимодействует с полимерной фибриллой, а дальше происходит его переход согласно гетеродимернои модели.
Основанием для такого предположения является некоторое несовпадение экспериментальных данных по кинетике прионного перехода с данными, рассчитанными для каждой из моделей (Serioer«/.,2000). Недавно в результате исследования прионного белка Sup35 дрожжей была сформулирована и подтверждена in vitro еще одна модель, получившая название «конформационной конверсии с помощью нуклеации» (Serio etal., 2000). Она заключается в том, что существуют две формы белка: растворенная S-форма и агрегированная А-форма (прионная конформация). Конформационные изменения происходят за счет присоединения S-формы к А-форме. При этом белок в S-форме может находиться как в моиомерной, так и в олигомерной форме. Особое свойство мономерного белка заключается в том, что он конформационно нестабилен, поэтому он только с очень малой вероятностью может превращаться в более стабильную А-форму. Однако конформационный преход может сильно ускоряться при присоединении мономеров к готовым «семенам» - агрегатам. В отсутствии «семян» S/A переход может быть облегчен, если он происходит в олигомерных комплексах. Такие олигомеры все еще представляют собой S-форму, но их субъединицы имеют значительно меньший набор возможных конформаций. Олигомеры и мономеры находятся в равновесии и могут переходить друг в друга (Serio at at., 2000). Эксперименты, проведенные in vitro с очищенным фрагментом дрожжевого прионного белка Sup35, подтверждают эту модель. Однако точный механизм этого процесса in vivo нуждается в прояснении. Насколько такая модель может быть распространена на приоиы млекопитающих, пока не известно. 1.3 ПРИОНЫ НИЗШИХ ЭУКАРИОТ 1.3.1 Нехромосомные детерминанты \Р8Ґ], [URE3] и [Р/Л ] дрожжей У дрожжей Saccharomyces cerevisiae описаны нехромосомно наследуемые генетические детерминанты [URE3] и [PSt], определяющие характерные для них фенотипы. В отличие от других наследственных детерминантов, их не удалось связать с какой-либо нуклеиновой кислотой, принадлежащей плазми дам, вирусам или митохондриям (Tuite et at., 1982; Coxet at., 1988). Необычность их свойств долгое время оставалась совершенно непонятной. В 1994 г. Викнер высказал гипотезу, которая не противоречила экспериментальным данным, накопившимся к тому времени (Wicklier, 1994). Она связывает эти детерминанты с приоиоподобным поведением некоторых клеткочных белков. Детерминант [PSI+] был изначально описан как цитоплазматически наследуемый фактор, приводящий к увеличению эффективности супрессии всех трех нонсенс-кодонов, хотя этой эффективности не всегда хватает для проявления супрессорного эффекта in vivo, а значит и для его обнаружения чисто генетическими методами (Firoozan et al., 1991).
Роль шаперонов в поддержании прионного состояния белков
Способность белка изменять свою конформацию с "нормальной" на "прионную", и в результате этого участвовать в образовании упорядоченных белковых агрегатов - ключевой момент в приоиообразовании. Исходя из этого, можно предполагать влияние клеточных шаперонов (или белков теплового шока) на кинетику данного процесса. Основная роль шаперонов в клетке - это укладка (фолдинг) вновь синтезируемых или неправильно свернутых белков. Поэтому они могут активно влиять на формирование определенной конформации у белка. Во всех организмах выделяют несколько крупных семейств шаперонов. Ниже приводятся краткие сведения по каждому из семейств, опираясь на Agashe et.al. (2000), Horwich etal. (1999), Bukauetflf.(1998) и Martin et.al (1997). Hsp70 (сокращение от heat shock protein, молекулярная масса около 70 кДа) -основной класс шаперонов в клетке. Эти белки выполняют очень много функций, среди которых фолдинг белков, транслокация белков через различные мембраны, стабилизация белков при тепловом шоке, общая регуляция экспрессии всех шаперонов, сборка и диссоциация макромолекулярных комплексов, деградация белков. Следует отметить, что Hsp70 играют доминирующую роль в фолдинге и рефолдинге клеточных белков среди всех шаперонов у эукариот, при этом они часто кооперируются с другими шаперонными системами. Как правило, для их работы необходимо присутствие еще одного класса белков - Hsp40. У бактерий они соответствуют системе DnaK и DnaJ. НырбО - так называемые "шаперонины" - мультисубъединичные комплексы. У Б. coli они участвуют в фолдинге примерно 10% всех клеточных белков (белок GroEL), однако у эукариот их роль ограничена. Hsp90 - класс шапероиов, которые необходимы для фолдинга некоторых белков, участвующих в передаче сигналов внутрь клетки (стероидные рецепторы, некоторые киназы). Hsp 100 - консервативное семейство белков (присутствует у бактерий, грибов и растений). Функция HsplOO состоит в разрушении крупных белковых агрегатов, образующихся в клетке в результате стрессовых воздействий, таких как, например, высокая температура или высокие концентрации этанола в среде (Parsell et ai, 1994).
Такой шаперон играет роль "молекулярного лома" и необходим для выживания при сильных стрессах (Lindquist et.al., 1995). Как правило, HsplOO работают в комплексе с другими семействами шаперонов. Например, в Е. coli с ними вместе работает протеазный каскад (помогают работать протеазе СІрР), в дрожжах - работают в комплексе с шаперонами Hsp70 и Hsp40. Показано, что комплекс Hspl04 (дрожжевой HsplOO), Hsp70, Hsp40-полностью восстанавливает активность денатурированной люциферазы in vitro (Glover et.al, 1997), причем no отдельности эти шапероны работают крайне неэффективно. Дрожжевой белок Hsp 104 является шапероном из семейства Hsp 100. Было показано, что поддержание детерминанта [PSP] клетками дрожжей зависит от экспрессии Hspl04. Делеция генаЯ5Р/04, кодирующего этот белок, приводит к исчезновению детерминанта [PSP], его сверхэкспрессия ослабляет супрессорный фенотип вызванный [PSP] (связанный с супрессией нонсенс-мутации), и часто вызывает потерю этого детерминанта (Chernoffer я/., 1995). При потере мультикопийной плазмиды, кодирующей ген HSP104, супрессорный фенотип восстанавливается, из чего был сделан вывод о том, что для поддержания [PSP] необходим "средний" уровень экспрессии Hspl04. Влияние Hspl 04 на детерминант [PSP] хорошо иллюстрирует прионную природу состояния [PSt]. Для объяснения этого влияния была предложена следующая гипотеза (Kushnirov and Ter-Avanesyan, 1998). Предполагается, что Hspl04 дробит прионные фибриллы Sup35 (из крупных фибрилл получаются мелкие, которые затем эффективно разрушаются до мономеров с помощью Hsp70/Hsp40), Поэтому сверхэкспрессия данного белка приводит к потере прионного детерминанта из-за активного "растворения" прионных агрегатов. Делеция данного белка приводит к потере детерминанта по другой причине. Прекращение дробления агрегатов приводит к тому, что в клетке вместо многих мелких возникает один крупный агрегат. При делении клетки этот агрегат останется только в одной из двух образовавшихся клеток, а вторая, как видно, освободится от прионного Sup35 (а, следовательно, и от [PSF]), Это рассуждение опирается на то, что весь приоиньш белок в клетке находится в виде нерастворимых агрегатов, что впрочем, косвенно подтверждается многими экспериментальными фактами (Paushkin et.ai, 1996; Patino et.ai, 1996).
Существует еще одна гипотеза, объясняющая факт того, что при делеции Hspl04 прионное состояние Sup35 теряется. По этой гипотезе Hspl04 тем или иным образом ответственен за полимеризацию фибриллы, т.е. конверсию мономерного белка в агрегированный - прионный (Patino etal, 1996; Serio et al., 2000). Здесь можно различать две возможности; 1. Hspl 04 необходим для предварительной укладки белка в «компетентную» форму, способную к переходу в агрегированное состояние, 2. Hspl 04 прямо катализирует и прямой и обратный переходы, т.е. сборку и разборку агрегатов соответственно. Уровень, на котором устанавливается равновесие зависит от концентрации Hspl 04. Например, сверхэкспрессия сдвигает равновесие в сторону разборки агрегатов. 1.5.3 Рост клеток на среде с GuHCI приводит к потере прионного фенотипа Гидрохлорид гуанидина (GuHCI) известен как хаотропный агент, денатурирующий белки. При росте клеток [PSt] на среде, содержащей малые концентрации GliHCl (1-5 mM ,слишком малых для денатурации белка) наблюдалась потеря прионного фенотипа (Tuite et al., 1981). Излечивание [PSI+] с помощью GuHCI происходит только в делящейся культуре (Eaglestone et al., 2000), /)5("] клетки появляются после примерно четырёх-пяти поколений. Было показано, что рост клеток в среде с GuHCI не вызывает разрушения уже существующих агрегатов Sup35 и не блокирует его дальнейшую полимеризацию, однако постепенно уменьшается количество клеток с агрегатами (Ness et al., 2002). Примерно тогда же было показано, что рост клеток в среде с GuHCl приводит к ингибированию шаперона Hspl04 (Ferreira et al, 2001). Это позволило предположить, что излечение [Р5Ґ] с помощью GuHCl происходит из-за инактивации Hspl04. Впоследствии это предположение получило ряд подтверждений. Мутации в гене HSP104 обеспечивали устойчивость [РЗҐ] к ДЄЙСТВІІЮ GuHCl (Jung et al., 2002), а также было показано, что GuHCl ингибировал АТФ-азную активность Hspl04 in vitro (Grirommger et al., 2004). Кроме того, было подтверждено, что HspI04 разбирает полученные in vitro фибриллы белка5ир35 на более мелкие (Shorter and Lindquist, 2004). Снижение количества или активности шаперона Hspl 04 в клетке приводило к уменьшению количества агрегатов Sup35, а также к увеличению их размера (Wegrzyn et al., 2001). Сверхэкспрессия этого шаперона уменьшала размер прионных агрегатов (Kushnirov et al., 2000), Все эти данные полностью согласуются с приведенными выше гипотезами о действии шаперона Hspl 04 наприонные агрегаты Sup35. Как и в случае [PSt], поддержание [PIN ] также зависит от шаперона Hspl04 (Sondheimer and Lindquist, 2000) и Sisl из семейства шалеронов Hsp40 (Sondheimer et al., 2001; Lopez et at, 2003). Однако сверхэкспрессия шаперона Hspl04 не приводит к потере [PIN ] (Derkatch et al., 1997).
Среды и условия культивирования микроорганизмов
2YT: 1 % дрожжевой зкстрактфіїсо), 1.6% триптон(Віісо), 0.5% NaCl. Твердые среды содержали 1.5% агара (Difco). В среды при необходимости добавляли соответствующие антибиотики: ампицилин, канамицин, хлорамфеиекол (Sambrook et ai, 1989). Культивирование бактерий проводилось при температуре 37С. 3.2.2 Среды для выращивания S. cerevisiae а) Полные среды. YPD: 1% дрожжевой экстракт (Difco), 2% пептон (Sigma), 2% глюкоза б) Минимальные среды: YNB: 0.67% Yeast Nitrogen Base {without amino acids) (Difco), 2% глюкоза. YNBCils: 0.67% Yeast Nitrogen Base without amino acid (Difco), 2% глюкоза, 0.5% казаминовых кислот (Difco). Твердые среды содержали 2% агара (Difco). Селективные среды содержали соответствующие аминокислотные и другие добавки (Sherman et aL, 1986), Штаммы дрожжей культивировали при температуре 30С. В жидких средах культуры бактерий и дрожжей выращивали до оптической плотности (СГОЙ00= 1 - 2). 3.3 ТРАНСФОРМАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Е. coli: Для трансформации Е. coli, использовали компетентные клетки, приготовленные по методу Inoue (Inoue et aL, 1990), К 100 мкл компетентных клеток добавляли 0.1 мкг плазмидной ДНК и выдерживали во льду 30 минут. После этого в течение 40 секунд при 42С проводили тепловой шок. Затем к клеткам добавляли 1 мл жидкой среды LB и инкубировали 40-50 минут при 37С. После инкубации клетки центрифугировали на микроцентрифуге "Eppendorf 1 минуту при 4000 об/мин, удаляли супернатант до 100 мкл. В оставшихся 100 мкл среды клетки ресуспендировали и высевали на твердую среду LB с антибиотиком. S. cerevisiae: Дрожжевые клетки для трансформации брали либо со свежего штриха (до 1 недели), либо из жидкой культуры (на логарифмической стадии роста). Приблизительно 3 мг клеток дрожжей наточку суспензировали в 200 мкл LiAc, осаждали в микроцентрифуге "Eppendorf 0.5 мин при 8000 об/мин, супернатант удаляли, клетки суспензировали в 70 мкл ацетата лития (100мМ) и инкубировали 20 минут при температуре 30С. После этого к клеткам добавляли ДНК-носитель (30 мкг), плазмидную ДНК (0.1 - 0.2 мкг), тщательно перемешивали, в последнюю очередь добавляли 90 мкл 60% раствора полиэтиленгликоля (до конечной концентрации 3 5%), перемешивали на средней скорости с помощью "Vortex" и инкубировали при 30С в течение 30 минут. После инкубации с плазмидной ДНК клетки подвергались тепловому шоку в течение 15 минут при 42 С (на водяной бане).
Затем смесь центрифугировали (1 минуту при 5000 об/мин), удаляли супернатант. Клетки суспензировали в стерильной дистиллированной воде в объеме 100 мкл и высевали на среду YNB. селективную для поддержания плазмиды (Gietz et al, 1995). Растворы: LiAc - Li Acetate lOOmM, Tris-HCl lOmM pH 7.5, EDTA ImM. ПЭГ (полиэтиленгликоль) 4000, 60%. ДНК-носитель - ДНК спермы лосося, фрагментиров энная ультразвуком и денатурированная кипячением. В работе были использованы стандартные методы дрожжевой генетики (Sherman et al, 1986), среди них рассев истощающим штрихом, метод селективных сред и метод отпечатков. 3,4.1 Генетическая система для детекции прионных фенотипов На основе фенотипического проявления прионного белка Sup35 была придумана система детекции прионных фенотипов (Сох, 1965;Derkatch et. al, 1997; Kushnirov et.al., 2000). Заменив прионный N-домен белка Sup35 на любую исследуемую кандидатную последовательность, можно тестировать ее на прионогенность и наблюдать прионный фенотип. Детекцию прионных фенотипов осуществляли визуально на чашке Петри, после чего брали 1 колонию, переносили в жидкую среду и наращивали до необходимого количества. Используемые штаммы дрожжей имеют либо нонсенс-мутацию ade2-l (UAA) и слабый UAA-супрессор SUQ5 для нее или нонсенс-мутацию adel-14 (UGA). При этом генотипическом фоне клетки, содержащие изучаемый нрион, могут расти на среде, не содержащей аденина, и имеют белый цвет колоний (Сох, 1965), Соответственно, клетки без приоиного детерминанта являются ауксотрофами по ад єни ну и имеют красный цвет колоний. На молекулярном уровне этот фенотип объясняется следующим образом: прионное состояние соответствует существенному недостатку функционально активной формы Sup35 (факторатерминации трансляции), что ведет к ухудшению эффективности терминации трансляции и супрессии нонсенс-мутации, но только в присутствии SUQ5 (Сох et.al, 1965). В клетках синтезируется белок, ответственный за синтез аденина (Ade). В [psi] клетках функция Sup35 не нарушается, и синтез белка Ade не происходит, а вследствие этого, происходит накопление красного пигмента, являющегося субстратом Ade (и продуктом белка-предшественника Ade в цепи синтеза аденина). Рестрикция плазмидной ДНК с помощью различных ферментов рестрикции, электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле, процедура сборки плазмид и трансформация в Е. coli выполнялись в соответствии с Sambrook et al. (1989). Когда это было необходимо, "тупление" "липких" концов фрагментов ДНК производилось с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимер азы. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля осуществляли при помощи набора реактивов QIAEXII (Qiagen) в соответствии с инструкцией производителя. Для получения штамма со сверхэкспрессией шапероиа Hspl04, штамм дрожжей 5V-H19 был трансформирован плазмидой YEplacl81-#P704 (мультикопийная дрожжевая плазмида, содержащая маркер LEU2), сконструированной ранее в нашей лаборатории (Kryndushkiri et.al, 2002). Был также получен штамм дрожжей, где ген HSP104 был заменен на этот же ген, но под регулируемым тетрациклиновьш промотором, где тетрациклин (или его аналог - доксициклин) выступал в качестве репрессора.
Из плазмиды рСМ188, по сайтам Ebel и BstXI (был затуплен фрагментом Кленова) был вырезан фрагмент, AJRS1+CEN4, ответственный за репликацию в дрожжах. Затем в эту плазмиду после тетрациклинового промотора, по сайтам Hpal и Hindlll, был вставлен фрагмент гена HSP104, вырезанного по сайтам BsaAI и НігкШІ, из плазмиды Y Epl&cl81-HSP104. В результате получили интегративную плазмиду pCMlffl-HSP104/N-mt Далее ее резали по сайту Bglll, трансформировали в используемый штамм дрожжей с вариантом [PSI+]ori с интеграцией в геном с помощью гомологичной рекомбинации на место геномного HSP104. Химерный белок Sup35, где N-концевая часть белка Sup35 Pichia methanolica была сшита с репортернои последовательностью МС-домен Sup35 Saccharomyces cerevisicie? был вставлен в дрожжевой вектор pRS315 (Kusbnirovet.al., 2000). Химерный белок, где С-концевая часть Publ была сшита с репортерами гемм-аглютинином (НА) и GFP в следующей последовательности HA-GFP-Publ, был вставлен в дрожжевой вектор yeplac 181 под промотер белка Sup35. Химерная конструкция, состоящая из полиглутаминовой части первого экзона хантингтина человека сшитой с GFP (Green Fluorescent Protein - зеленый флюоресцирующий белок) в дрожжевом векторе pYES2 под G&I1 промотером была предоставлена лабораторией М. Шермана, и была описана в статье Merlin et al., 2002. Образцы культуры клеток НЕК293 были получены в лаборатории М. Шермана, как описано в статье Meriin et al., 2003. Для экспрессии в этих клетках химерного белка хантингтина, такой химерный белок, сшитый с GFP, был вставлен в плазмиду pCDNA3.1 под конститутивный цитомегаловирусный промотер, что было описано в статье Meriin et al. (2003). Химерные полиглутамин-богатые белки были получены в нашей лаборатории А.Б. Вишневской (неопубликованные данные). В данной работе мы использовали три белка: Q70 и Q85, которые состояли из 70 и 85 остатков глутамина, сшитых с МС-доменом белка Sup35 дрожжей S. cerevisiae. QY76, который состоял из 76 остатков глутамина/тирозина в соотношении 4/1 (61 глутаминов и 15 тирозинов - QQQYQ), сшитыми с МС-доменом белка Snp35 дрожжей S. cerevisiae, который обеспечивал возможность наблюдать фенотип (аналогично приону Sup35; описано выше), а также обеспечивал возможность иммунодетекции антителами к белку Sup35. Данные химерные белки были трансформированы в штамм 74-D694 где была сделана деления геиа SUP35 (sup35:: TRP1), при этом было необходимо присутствие плазмиды, несущей спасающий ген SUP35, где были изъяты NM-домены белка Sup35, После трансформации «спасающую» плазмиду изгоняли последовательными расклонами, после чего можно было наблюдать прионный фенотип исследуемых химерных белков.
Анализ искусственных прионов, сконструированных на основе голиглутамина, и их сравнение с SUP35
мы исследовали свойства белков, содержащих полиглутаминовые последовательностью с помощью метода SDD-AGE. Известно, что дрожжевые прионные белки обогащены остатками глутамина и аспарагина. Так, прионный домен белка Sup35 содержит 27% Gin и 18% Asn. Кроме того, в нем содержится 17% Туг и 17%о Gly, а заряженные аминокислоты практически не встречаются. Подобный аминокислотный состав прионного белка более важен для прионообразования, чем конкретная последовательность, как было показано в работе (Ross et.al. 2005). Последовательность полиглутамина достаточной длины способна образовывать амилоидную структуру (Perutz et.al., 2003), Так, удлинение полиглутаминовой последовательности белка хантингтина приводит к амилоидной полимеризации и развитию болезни Хантингтона. Агрегацию полиглутаминовой последовательности также наблюдали в клетках дрожжей (Meriin et.al, 2003). Однако, последующий анализ показал, что эти агрегаты не наследуются, из-за плохого распознавания и фрагментации шапероном Hspl04 (Salnikova et.al. 2005). Для хорошего опознавания шапероном необходимо присутствие экспонированных гидрофобных остатков (Alberts et.al. 2002), а остатки глутамина таковыми пе является. Мы предположили, что распознавание амилоида шапероном Hspl 04 может быть улучшено добавлением остатков тирозина, который представляет наиболее часто повторяющуюся гидрофобную аминокислоту в прионном домене белка Sup35. Для этого мы изучили полимеризацию химерного белка, содержащего полиглутаминовую последовательность (polyQ) и последовательность глутаминов, смешанных с тирозинами (polyQY) в пропорции 4:1. Были созданы и изучены три химерные конструкции содержащие 70 и 85 остатков глутамина, а также 76 остатков глутамина и тирозина в пропорции 4:1, сшитых с МС-доменом белка Sup35, для краткости - Q70, Q85 и QY76 соответственно. Эти белки были использованы в наборе экспериментов, аналогичных экспериментам с Sup35, описанным в первой части настоящей работы.
Для их интерпретации мы использовали понятия и предположения, сформулированные при исследовании полимеров Sup35. 4.3.1 Прионоподобные характеристики Q70, Q85 и QY76 При экспрессии белков Q70, Q85 и QY76 в штамме дрожжей [PIN1 } оказалось, что все они сразу начинали образовывать полимеры (Рис. 12В) и приводили к образованию колоний розового цвета (Рис. 12А), что означает наличие слабой супрессии нонсенс кодонов при трансляции (степень окраски обратно пропорциональна эффективности супрессии нонсенс мутации adel-14, мутации в этом гене приводят к ауксотрофности по аденину и накоплению красного пигмента). При экспрессии гена SUP35 в клетках такого штамма супрессии и появления прионного состояния не происходит (Chernoff et.al 1993). [PSt] фенотип начинает возникать de novo только при сверхэкспрессии Sup35, причем с низкой частотой (10"6 на клеточное деление). Таким образом, частота возникновения de novo прионоподобной конформации исследуемых полиглутаминовых белков существенно превосходит таковую у [PSP]. Эффективность нонсенс супрессии в клетках, экспрессирующих химерные белки, нарастала в ряду Q70 Q85 QY76. Супрессия коррелировала с количеством мономерного белка (Рис. 12Б), то есть чем меньше было количество мономера, тем эффективнее была супрессия, хуже терминация трансляции. Это подтверждает, что супрессия является индикатором эффективности полимеризации белков. При анализе SDD электрофорезом (Рис. 12В) оказалось, что все эти белки образуют амилоидоподобные полимеры. Полимеры Q70 и Q85 намного превосходили по размеру полимеры QY76 (Рис. 12В). Для сравнения, полимеры Sup35 в клетках [PSt] имели промежуточный размер между полимерами Q70/Q85 HQY76(PHC. 12В). В соответствии с предположением о том, что гидрофобные остатки тирозина могут способствовать эффективной фрагментации с помощью шаперона Hspl04, оказалось, что полимеры QY76 были меньше, чем полимеры Q70 и Q85 (Рис. 12В). Полимеры белка Sup35 были промежуточного размера, что, вероятно, означает, что они фрагментируются лучше, чем полимеры Q70 и Q85, но хуже, чем полимеры QY76 (Рис. 12В), В последующих экспериментах мы решили детально исследовать влияние Нзр104 на размер полимеров polyQ и polyQY. 4.3.2 Размер прионных полимеров белков Q70 и QY76 зависит от активности шапероиа Hspl04. Известно, что шаперон Hspl04 существенен для поддержания прионного состояния [PSt]. Мы показали, что уменьшение его активности увеличивает размер полимеров Sup35. Чтобы проверить влияние Hspl04 на полимеры Q70 и QY76 в клетках, экспрессирующих эти белки, была сделана делеция гена HSP104. Агрегация белка Q70 зависит от гена HSP104, поскольку его делеция приводила к исчезновению соответствующих полимеров (Рис. 13). Это может означать либо то, что полимеры Q70 подвержены фрагментации с помощью Hspl04, либо, как это было предположено ранее (Merlin et.al, 2003), его поддержание может зависеть от приоиа [PW], который не способен существовать в отсутствие Hspl04. В отличие от Q70, полимеры QY76 ие исчезали при делеция HSP104. Вскоре после делеции HSP104, т.е. через 30 клеточных поколений (минимальное время, требуемое для роста дрожжевой колонии из одной клетки), полимеры не обнаруживались, либо их количество было мало (Рис. 13).
Однако, полимеры QY76 были обнаружены после 150 поколений, эффективная полимеризация восстановилась. При этом размер полимеров был значительно увеличен по сравнению с полимерами, образованными в присутствии Hspl04 (Рис. 13), Введение гена HSP104 в такие клетки приводило к восстановлению исходного размера полимеров (Рис. 13). Таким образом, полимеры QY76 могут фрагментироваться и наследоваться и в отсутствии шаперона Hspl04, хотя в присутствии Hspl04 фрагментация происходит намного эффективнее. Полученные данные означают, что динамика полимеризации QY76 зависит от Hspl04. Однако делеция HSP104 не нарушает процесс полимеризации, как в случае Sup35 и Q70. Это можно объяснить как наличием НврКИ-независимой фрагментирующей активности, так и очень высокой эффективностью образования таких полимеров de novo. Во втором случае, эффективность образования полимеров не должна зависеть от времени, однако, это противоречит полученным данным (Рис. 13) и, значит, это объяснение можно исключить. Делеция HSP104 в клетках, экспрессирующих QY76, поначалу привела к практически полному прекращению полимеризации, что хорошо заметно через 30 поколений после делеции, однако полимеризация восстановилась в дальнейших клеточных поколениях. Видимо, исходные полимеры QY76 не были способны эффективно фрагментироваться и наследоваться в отсутствие Hspl04 и было необходимо время для образования новой структуры, которая могла бы наследоваться за счет Hspl04-независимой фрагментации. Размер полимеров QY76 в клетках с делецией HSPJ04 был в 4-6 раза больше, чем без делеции. Это, вероятно, означает, что Hspl04-независимая фрагментирующая активность была в несколько раз менее эффективна. 4.3.3 Присутствие GuHCl в среде приводит к увеличению размера прионных полимеров белков Q70 и QY76. Чтобы подтвердить данные о влиянии шаперона Hspl04 на исследуемые прионоподобные полиглутаминовые белки, мы исследовали кинетику полимеризации в присутствии GuHCl, который, как ранее было показано, полностью ингибирует активность Hspl04 (Ferreira et.al., 2001). После внесения реагента в среду клетки собирали через 2 и 10 поколений. Присутствие в среде GuHCl приводило к увеличению размера полимеров Q70 (Рис. 14), однако это увеличение было незначительным. Отсутствие значительного увеличения может быть связано с техническими причинами. Полимеры Q70 велики и их наиболее крупная фракция в результате различных процедур может быть утеряна, например, она может оставаться в клеточном дебрисе при осветлении лизата, разрушена стеклянными бусами или недостаточно хорошо перенесена из агарозного геля на мембрану.
