Исследование регуляции Н^+-АТФазы плазматических мембран высших растений белками 14-3-3 при абиотическом стрессе Шанько Андрей Викторович

Содержание к диссертации

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 5

/./. Стратегия восприятия стресса у растений 5

1. Передача сигнала при абиотическом стрессе 6

2. Воздействие солевого и осмотического стрессов на растения 14

3. Воздействие низких температур на растения 18

4. 14-3-3 белки — клеточные регуляторы растительного метаболизма 26

5. 14-3-3 белки как активаторы Н*-АТФазы плазматических мембран 34

6. Цели и задачи исследования 39

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 41

1. Объекты исследования 41

2. Выращивание растений и создание абиотических стрессов 41

3. Определение морозостойкости озимой пшеницы 43

4. Определение солеустойчивости сортов ячменя 45

5. Определение содержания ионов Na в тканях растений 45

5. Измерение транспортной активности Н -АТФазы в корнях проростков ячменя 45

6. Выделение плазматических мембран из растений 46

7. Измерение количества ФКСС в плазматических мембранах растений 47

8. Измерение АТФ-гидролазной активности Н-АТФазы в плазматических мембранах растений 47

9. Вестерн блоттинг белков 14-3-3 48

10. Выделение РНК из растений 49

11. Синтез кДНК (реакция обратной транскрипции) 49

12. Дизайн праймеров 50

13. ПЦР 50

14. Измерение экспрессии генов 14-3-3 белков 51

15. Определение меристемы и зоны перехода клеток к растяжению в корнях проростков кукурузы 52

16. Определение зон закисления и защелачивания внешней среды апексом корня кукурузы 53

17. Измерение транспортной активности Н*-АТФазы в корнях проростков кукурузы 53

18. Выделение мембран, ДСН-ПААГЭ и иммунодетекция 14-3-3 белков из корней проростков кукурузы 54

19. Статистическая обработка данных 55

20. Реактивы 55

3. РЕЗУЛЬТАТЫ 57

3.1. ДЕЙСТВИЕ СОЛЕВОГО И ОСМОТИЧЕСКОГО СТРЕССОВ НА РАСТЕНИЯ ЯЧМЕНЯ HORDEUM DISTICUM L57

3.1.1. Определение солеустойчивости сортов ячменя 57

2. Накопление ионов Na* в корнях проростков ячменя при солевом стрессе 58

3. Измерение выхода протонов из отделенных отрезков корней проростков ячменя 59

4. Измерение АТФ-гидролазной активности К -АТФазы, количества ФКСС, количества белка Н* -АТФазы и белков 14-3-3 в препаратах плазматических мембран из корней проростков ячменя 60

5. Измерение экспрессии изоформ генов 14-3-3 белков в корнях проростков ячменя 64

3.2. Действие солевого и осмотического стрессов на апекс корня проростков кукурузы .... 67

1. Определение меристемы и зоны перехода к растяжению клеток апекса корня проростков кукурузы 67

2. Измерение тока протонов в отрезках апекса корня проростков кукурузы 71

3. Иммунодетещия белков 14-3-3 по длине апекса корня проростков кукурузы 72

3.3. Действие солевого стресса на растения томата 74

4. Определение солеустойчивых сортов томата и накопления ионов N а* в растениях при солевом стрессе 74

5. Измерение количества ФКСС в целых растениях томата, количества ФКСС и ингибирования роста корня в проростках томата при солевом стрессе 76

3.4. Действие холодового стресса на растения томата, огурца и озимой пшеницы 78

6. Определение морозостойкости пшеницы 78

7. Измерение количества ФКСС в проростках озимой пшеницы при холодовом стрессе.... 79

8. Измерение количества ФКСС в томатах, огурцах и пшенице при холодовом стрессе.... 80

4. ОБСУЖДЕНИЕ 81

9. Действие холодового стресса на растения томата, огурца и озимой пшеницы 81

10. Действие солевого и осмотического стресса на растения ячменя 83

11. Действие солевого стресса на растения томата 86

12. Действие солевого и осмотического стресса на апекс корня кукурузы 88

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 92

6. ВЫВОДЫ 94

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 95

8. СПИСОК ИЛЛЮСТРАЦИЙ 117

9. БЛАГОДАРНОСТИ 119

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ABRE - ABA-responsive element, элемент генома, отвечающий на действие АБК,

CDPK - Са²⁺-зависимые протеинкиназы,

DRE - drout-responsive element, элемент генома, отвечающий на действие осмотического стресса,

EST - expressed sequence tag - экспрессируемые части генома,

GPCR - рецептор ассоциированный с G-белком,

1Р₃ - инозитол 1, 4, 5 - трифосфат,

LEA-подобные гены - Late Embryogenesis Abundant гены,

LTRE - low temperature-responsive element, элемент генома, отвечающий на действие низких температур,

МАРК - митоген активируемые протеинкиназы,

PIP 2 - фосфатидилинозитол 4, 5-бифосфат,

PLC - фосфолипаза С,

PLD - фосфолипаза D,

ROS - reactive oxygen species, активные формы кислорода,

SOS — salt overless sensitivity, изначально мутанты арабидопсиса с блокированными генами, критическими в солеустойчивости растения, а так же сами гены,

АБК, ABA - абсцизовая кислота,

ДСН-ПААГЭ - полиакрил амидный гель-электрофорез с додецилсульфатом натрия (денатурирующий),

ФК - фузикокцин,

ФКСС - ФК-связывающие сайты, рецепторы ФК.

Введение к работе

Низкая температура, засуха и высокие концентрации соли - основные стрессовые факторы, неблагоприятно воздействующие на рост и развитие растений и снижающие урожайность сельскохозяйственных культур. Исследование молекулярных механизмов восприятия сигналов внешней среды и передачи их внутри клетки для активации адаптивного ответа - одна из фундаментальных задач современной биологии растений. Понимание молекулярных основ адаптации растений к стрессу имеет значение в селекции и биотехнологии, для проведения рационального скрещивания при выведении новых сортов и получении трансгенных растений.

Ведущую роль в поддержании гомеостаза клеток растений при абиотическом

стрессе играет Н⁺-АТФаза плазматических мембран, а одними из известных

регуляторов активности фермента являются белки 14-3-3. Белки 14-3-3

представляют собой семейство гидрофильных, консервативных регуляторных

белков, широко распространенных в клетках животных и растений. В

аминокислотной последовательности белков 14-3-3 имеется консервативная

центральная область, ответственная за связывание с белками-мишенями, и

вариабельная область С-конца, обладающая изоформ-специфичными функциями

[Ferl, 2000]. Комплексобразование между белками 14-3-3 и Н⁺-АТФазой происходит

при фосфорилировании специфического мотива С-концевого автоингибиторного

домена Н⁺-АТФазы, при этом фермент активируется [(Decking et al. 1997]. Активация

фермента приводит к гиперполяризации плазматической мембраны, увеличению

АрН между цитоплазмой и периплазмой и, следовательно, к возрастанию движущей

силы для потоков ионов и метаболитов внутрь клеток. Ранее в нашей лаборатории

было обнаружено участие 14-3-3 белков в регуляции активности Н⁺-АТФазы в

плазматических мембранах протопластов и клетках суспензионной культуры

сахарной свеклы при абиотическом стрессе [Chelysheva et al. 1999, Babakov et al.

2000]. В настоящей работе основное внимание уделено регуляции Н⁺-АТФазы

плазматических мембран белками 14-3-3 в целых растениях при ответе на различные

абиотические стрессы - солевой, осмотический и холодовой.

5 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Похожие диссертации на Исследование регуляции Н^+-АТФазы плазматических мембран высших растений белками 14-3-3 при абиотическом стрессе

Регуляция H +-АТФазы плазматических мембран высших растений в условиях абиотического стресса : Роль белков 14-3-3Челышева Вера Викторовна

Исследование регуляции экспрессии генов цитохрома Р450 подсемейства 1А в печени инбредных линий мышейМихайлова Ольга Николаевна

Свойства 4/1-подобных белков растений - возможных факторов внутри- и межклеточного транспортаМинина Елена Андреевна

Структурные и функциональные особенности рибосом-инактивирующих белков растения Ricinus communisСавочкина Юлия Анатольевна

Получение трансгенных растений томата, продуцирующих химерный белок TBI-HBsAg, и изучение иммуногенных свойств плодов этих томатовПоздняков Сергей Геннадьевич

Биохимические свойства белков, участвующих в образовании транспортных форм у некоторых РНК-содержащих вирусов растенийКалинина Наталья Олеговна

Изучение функций различных доменов нового транскрипционного коактиватора SAYP (E(y)3) Drosophila melanogaster и поиск взаимодействующих с ним белковНиколенко Юлия Владимировна

Делеционное картирование короткого плеча хромосомы 3 человека в четырех типах рака с помощью панели высокополиморфных микросателлитных маркеровБазов Игорь Валентинович

Поиск и характеристика онко-ассоциированных генов на хромосоме 3 человека с помощью сравнительной геномной гибридизации на NotI-микрочипахПавлова Татьяна Владимировна

Изменение метилирования промоторных областей семи генов хромосомы 3 человека в эпителиальных опухоляхХодырев Дмитрий Сергеевич