Введение к работе
Актуальность темы. Гормон роста человека, продуцируемый передней долей тофиза, состоит из одной полипептидной цепи длиной 191 аминокислотный остаток, иа из основных его функций - стимуляция соматического роста. Однако, помимо )го, ГР человека обладает также лакгогенной, инсулинподобной и диабетогенной гивностями, вызывает активацию макрофагов и ряд других биологических эффектов.
ГР был впервые испытан в медицинской практике в 1958 году и с тех пор все тире вменяется для лечения случаев гипофизарной карликовости у детей, а также в іестве анаболического средства при лечении ожогов и костных переломов. ;ширение практики клинического применения ГР ведет к необходимости детального 'чения его физико-химическических свойств и биологических активностей.
Тот факт, что в основе многочисленных эффектов, вызываемых ГР, лежит его )Собность связываться со специфическими рецепторами, расположенными в мбранах клеток, означает, что каждой из активностей этого гормона может быть ггавлен в соответствие определенный участок (или участки) его полипептидной цепи, сартировании такого рода участков за последние 10-15 лет достигнут значительный згресс, в немалой степени благодаря применению методов генной инженерии, гановлен молекулярный механизм узнавания ГР своих рецепторов и цепочка іьггий, которая следует за связыванием лиганда. Решена третичная структура ГР говека в индивидуальном состоянии и в комплексе с рецепторами. Однако, іуктурньїе основы стабильности ГР изучены слабо. Имеется всего лишь одна работа, : авторы измерили вклад в белковую стабильность остатков, находящихся на N-конце ірой спирали ГР человека (Zhukovsky et al., 1994). Взаимосвязь между активностью и бильностью ГР не изучалась вообще. Нет ни одного случая, когда бы удавалось >ысить стабильность гормона при помощи изменения его первичной структуры.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось установление имоотношений между структурой, функцией и стабильностью молекулы ГР человека і помощи конструирования гибридов, составленных из сегментов [зкородственных белков ГР человека/ГР свиньи, и сравнительного изучения их йств. Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие задачи: а) работка метода получения представительного набора гибридных яедовательностей ДНК; б) получение генов гибридных гормонов; в) разработка
высокоэффективной системы экспрессии и очистки гормонов; г) изучеш биологической активности и физико-химических свойств гибридов.
Научная новизна и практическая ценность работы. Разработан оригинальны метод получения гибридных последовательностей ДНК - метод рекомбинаци гомологов. Этот метод был использован для создания набора гибридных генов і основе генов ГР человека и ГР свиньи. Получены бактериальные штаммі продуцирующие в больших количествах природные и мутантные белки (до 300 мг/л Разработала оригинальная схема очистки гормонов. Определена лактогенн; активность гибридов в тесте на клетках Nb2-11С лимфомы и картирован участок 40-1 в молекуле ГР человека, ответственный за проявление данной активности. Изучеі внутриклеточная растворимость гибридных гормонов при их синтезе в Е. соїі. Показаі взаимосвязь между внутриклеточной растворимостью гибридов и их биологическс (лакгогенной) активностью. Проведено сравнительное изучение термостабильносі полученных гибридных молекул и их равновесной денатурации в присутстві гидрохлорида гуанидина. Обнаружена прямая корреляция между термостабильность гибридных белков и интенсивностью их спектров кругового дихроизма. Установлеї прямая зависимость между степенью кооперативности перехода глобула - клубок пс действием гидрохлорида гуанидина и внутриклеточной растворимостью гибриднь гормонов.
Апробация работы. Материалы исследований по теме диссертации доложены і следующих российских и международных конференциях: VI-ой Конференщ Российской Федерации «Новые направления биотехнологии» (Пущино, 1994 Международном Зимнем Симпозиуме по Биотехнологии в Майами «Белков: инженерия и структурная биология» (США, 1995), Международной конференщ памяти акад. А. А. Баева (Москва, 1996) и VIII-ой Конференции Российской Фсдеращ «Новые направления биотехнологии» (Москва, 1998).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано восемь печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на страниц;
машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальго
части, результатов и обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Рабо
содержит таблиц и рисунков.