Введение к работе
Актуальность проблемы;
Применение гибридизации для секвенирования ДНК было независимо предложено в конце восьмидесятых годов четырьмя группами: в СССР (Лысов и др., 1988), в Югославии (Drmanac et al., 1989) и двумя в Англии (Bains & Smith, 1988; Southern, 1988). Сущность этого метода состоит в том, что исследуемую ДНК гибридизуют со всевозможными олигонуклеотидами длины п и определяют те из них, которые образуют совершенные дуплексы. Затем последовательность исследуемой ДНК восстанавливают по перекрывающимся участкам (длины п-1) этих олигонуклеотидов. Но из-за сложности создания микроматрицы, содержащей полный набор олигонуклеотидов достаточной длины и с достаточной степенью чистоты, в настоящее время гибридизация с олигонуклеотидными матрицами не применяется к тем задачам, для которых она была предназначена изначально. Применение данного метода сейчас лежит в области диагностики мутаций (Mirzabekov, 1994; Yershov et al, 1996, Chee et al., 1996), наблюдения экспрессии генов (Lockhart et al., 1996) и сравнительного исследования гибридизационных свойств олигонуклеотидов (Case-Green & Southern, 1994; Southern et al,1994; Williams et al, 1994). В этих применениях метод гибридизации с олигонуклеотидными микроматрицами становится весьма эффективен из-за параллельности гибридизации. Вместе с тем, необходима высокая надежность результатов гибридизации и правильность их интерпретации. Цель работы;
Целью работы была разработка метода непрерывной регистрации сигналов при гибридизации с олигонуклеотидными микроматрицами и применение его для повышения надежности гибридизационных результатов и правильности их интерпретации. Это включает в себя разработку метода регистрации кривых
плавления (как равновесного так и не равновесного) и кривых изменения сигнала при ступенчатом изменении температуры. С помощью этих базисных процедур проводится измерение термодинамических параметров для дуплексов иммобилизованных олигонуклеотидов, дискриминация перфектных и неперфектных дуплексов при диагностике мутаций, и оценка относительного количества вещества, способного гибридизоваться с данной ячейкой микроматрицы. Научная новизна:
Был разработан основанный на регистрации равновесных кривых плавления метод определения термодинамических параметров для дуплексов, иммобилизованных в геле олигонуклеотидов. Были измерены термодинамические параметры ряда дезоксиоктадуплексов и обнаружена корреляция между параметрами для иммобилизованных в геле и находящихся в растворе дуплексов. Было показано, что флюоресцентная метка слабо понижает стабильность дуплексов. Предложено объяснение найденного понижения стабильности влиянием амидных групп геля. При диагностике Р-талассемических мутаций методом регистрации неравновесных кривых плавления были определены гомозиготные и гетерозиготные мутации. Для повышения надежности идентификации мутаций были использованы кривые роста гибридизационного сигнала. Публикации
По результатам диссертации опубликованы две печатные работы, ссылки на которые даны в конце автореферата. Структура работы
Диссертация состоит из введения, четырех глав (литературный обзор, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов), выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 73 страницах машинописного текста, содержит 10 рисунков и 5 таблиц.