Введение к работе
Актуальность проблемы. Вирус гепатита С является возбудителем широко распространенного заболевания человека с высокой вероятностью хронизации и малигнизации, характеризуется малыми размерами, низкими темпами размножения и узким спектром видовой и тканевой тропности. Вместе с тем до настоящего времени отсутствовали общепризнанные надежные модельные клеточные системы in vitro для репликации вируса, а те клеточные модели, о которых появились публикации в последнее время, не приобрели широкого распространения. Это определяет малую доступность вирусных белков и их недостаточную изученность.
Гуморальный иммунный ответ, его динамика и структура, хотя и находятся в стадии активного изучения, пока во многом остаются невыясненными. Большая часть работ по вирусу гепатита С (ВГС или HCV) посвящена вопросам эпидемиологии и диагностики инфекции. На молекулярном уровне проводится изучение нуклеотидных последовательностей генов структурных и неструктурных белков. Исследования на уровне белков касаются главным образом совершенствования диагностики и проводятся с использованием синтетических аналогов (пептидов и рекомбинантных полипептидов) основных белков ВГС. Одним из эффективных экспериментальных инструментов для изучения вирусных белков являются моноклональные антитела (МКА). МКА к основным белкам ВГС получены в нескольких лабораториях; они используются в основном для изучения локализации антигенов ВГС в клетках печени больных гепатитом С. Сведения об эпитопной специфичности и топологии антигенных детерминант противоречивы. В то же время они необходимы для решения как ряда фундаментальных проблем молекулярной биологии ВГС, так и задач практического здравоохранения, связанных с гепатитом С. Это указывает на актуальность темы диссертационной работы.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование иммунного ответа на белок нуклеокапсида вируса гепатита С и изучение антигенных свойств этого белка ВГС с помощью МКА.
Для достижения этой цели ставились следующие задачи:
- экспрессировать в E.coli рекомбинантные ДНК, кодирующие
иммунологически активные участки HCcAg;
- разработать схему очистки и концентрирования рекомбинантного белка
HCcAg;
разработать способ иммуноферментного выявления антител к вирусу гепатита С, основанный на использовании полученного рекомбинантного HCcAg и гибридных белков, содержащих фрагменты кор-белка ВГС в качестве антигена, сорбируемого на твердой фазе;
получить гибридомные линии, стабильно продуцирующие высокоаффинные МКА, направленные к HCcAg;
- изучить свойства МКА и определить их зпитопную специфичность;
-установить возможность использования МКА для обнаружения
рекомбинантного кор-антигена;
-исследовать взаимодействие МКА с нативным кор-белком в плазмах крови ВГС-позитивных доноров.
Научная новизна. В ходе выполнения диссертационной работы разработаны методы получения и очистки рекомбинантного полипептида - внутреннего белка кор вируса гепатита С, экспрессированного в E.coli и содержащего 1-150 а.о.
Экспрессированы в E.coli 7 гибридных белков, содержащих антигенно и иммуногенно активные фрагменты HCcAg.
Получен антигенно активный препарат HCcAg, степень чистоты которого позволяет использовать его для выявления антител к ВГС в сыворотках больных гепатитом С и инфицированных ВГС лиц. Доказана эффективность использования
рекомбинантного кор-белка как компонента иммуноферментных тест-систем да выявления антител к ВГС.
Получена панель высокоаффинных МКА, специфичных по отношению четырем неперекрывающимся эпитопам N- и С-концевых участков HCcAg.
Показана способность полученных МКА опознавать антигенные детерминант] нативного HCcAg.
Разработан чувствительный метод выявления рекомбинантного и нативног кор-белка ВГС при помощи "сэндвич"-варианта ИФА с использованием МК/ Полученные результаты могут быть использованы при диагностике гепатита С, а такж в клинической практике при прогнозе развития вирусного гепатита С и оценк патогенеза заболевания.
Направленность и ценность работы. Выполняя диссертационную работу, мі преследовали цели как фундаментального, так и прикладного характера. К первом направлению можно отнести получение панели высокоаффинных моноклональны антител, специфичных по отношению к индивидуальным неперекрывающимс эпитопам N- и С-концевых участков нуклеокапсидного белка вируса гепатита С Данные антитела способны опознавать антигенные детерминанты нативного HCcAg.
Метод выявления нативного белка позволяет анализировать вирусный белої находящийся в составе различных морфологических форм вируса гепатита С содержащихся в плазме. Это является важным аспектом в клинической практике пр прогнозе развития вирусного гепатита С.
Практическая ценность данной работы состоит в получении рекомбинантны белков, содержащих антигенно активные фрагменты, препараты которых могут быт использованы при выявлении антител к ВГС в составе диагностических тест-систем.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Разработанные методы получения и очистки рекомбинантного полипептида внутреннего белка кор вируса гепатита С (1-150 а.о.) обеспечивают выделет очищенного и концентрированного белка в препаративных количествах.
-
На основе очищенного рекомбинантного кор-белка создан иммуноферментны тест, позволяющий обнаруживать антитела к ВГС с высокой чувствительностью специфичностью.
3. Получена панель высокоаффинных МКА, способных опознавать четьц
неперекрывающихся антигенных детерминанты кор-белка, две из которых находятся у
N-конце, а две других - на С-конце HCcAg, что было установлено с применением сем
гибридных белков, содержащих фрагменты белка нуклеокапсида ВГС : 19-31 а.о., 1-і
а.о., 1-80 а.о., 1-160 а.о., 55-72 а.о., 33-56 а.о., 58-84 а.о.
4. Предложенный"сэндвич"-вариант ИФА с использованием четырех МК
различной специфичности позволяет выявлять нативный белок нуклеокапсида ВГС
плазмах инфицированных ВГС лиц.
Апробация работы. Результаты работы представлены на IX международно симпозиуме по вирусным гепатитам и заболеваниям печени (1996 г., Рим), на международном конгрессе по вирусологии (1996 г., Иерусалим), на IV Российскс национальном конгрессе "Человек и лекарство" (1997г., Москва), на II Российскс научно-практической конференции с международным участием "Гепатиты В, С, D и G проблемы диагностики, лечения и профилактики" (1997г., Москва). Результаты работ доложены и обсуждены на совместной конференции отдела молекулярной вирусолоп и Совета по предварительной экспертизе диссертаций НИИ вирусолоп им.Д.И.Ивановского РАМН 19 июня 1997 г.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литератур]
экспериментальной части, результатов и их обсуждения и выводов. Объ«
диссертационной работы составляет j/^встраниц машинописного текста. Полученные результаты иллюстрированы ^ таблицами, J.2- рисунками. Список литературы включает /ГО наименований.