Введение к работе
Актуальность темы. ДНК полимеразы являются основными ферментами клетки, обеспечивающими сохранение, воспроизведение и изменение генетической информации.
В настоящее время хорошо изучены ДНК полимеразы многих мезофильных организмов. Наиболее полно охарактеризована ДНК полимераза I E.coli, являющаяся односубьединичным белком. Представления о структуре и свойствах ДНК полимераз термофильных эубактерий сформировались, в основном, при изучении ферментов из разных видов бактерий одного рода - Thermus. Практически не исследованы ДНК полимеразы группы экстремально термофильных эубактерий, объединяющей микроорганизмы с оптимумами роста выше 70С. Отсутствие такой информации не позволяет делать обобщающие заключения об особенностях молекулярного строения ферментов, обеспечивающих метаболизм ДНК при температурах, близких к точке ее плавления.
Изучение новых термостабильных ДНК полимераз интересно и с практической точки зрения. При этом можно найти "идеальный фермент" амплификации ДНК в цепной полимеразной реакции (ПЦР), который характеризовался бы высокой процессивкостыо и точностью работы. Кроме того, новые ферменты могут обладать еще неизвестными полезными свойствами.
Цель работы и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в изучении структуры генов и характеристике рекомбинантных ДНК полимераз двух малоизученных экстремально-термофильных анаэробных бактерий Thermotoga пеароШапа и ЛпаегосеЛит thermophilum.
В ходе работы решались следующие задачи:
разработка стратегии клонирования генов ДНК полимераз термофильных бактерий и выделение соответствующих генов из геномных библиотек Thermotoga пеароШапа и Anaerocellum thermophilum.
определение их нуклеотидной последовательности;
изучение свойств рекомбинантных ферментов и оценка возможности их использования для ПЦР;
- оценка точности репликации ДНК рекомбинантными ферментами в модельной системе
in vitro.
Научная новизна и практическая ценность работы. Предложена простая и эффективная стратегия клонирования генов, кодирующих термостабильные ДНК полимеразы, основанная на прямом отборе из плазмидных геномных библиотек клонов, синтезирующих термостабильный фермент.
Определена нуклеотидная последовательность генов ДНК полимераз Т. neapolitana (TNE) и A. thermophilum (АТН) и проведен структурно-функциональный анализ кодируемых ими полипептидов. Обнаружено, что ДНК полимеразы АТН и TNE относятся к семейству A ( Pol I подобных) ДНК полимераз. Показано, что ДНК полимераза TNE является единственным термостабильным структурным и функциональным аналогом ДНК полимеразы IЕ. coli, известным в настоящее время.
Изучены основные параметры ДНК полимеразной реакции, термостабильность рекомбинантных ферментов АТН и TNE, а также присутствие дополнительных экзонуклеазных активностей. Обнаружено существенное влияние N-концевого (5'- 3'- экзонуклеазного) домена ДНК полимеразы TNE на 3'-5'-экзонуклеазную активность и на термостабильность фермента.
Показана возможность использования TNE М284 ( укороченной формы ДНК полимеразы TNE ) для амплификации ДНК в ПНР. Исследована точность синтеза ДНК в системе фага M13mp2 in vitro полноразмерной TNE и ее укороченным вариантом TNE М284.
Таким образом, результатом проведенной работы является предварительная характеристика двух новых термостабильных ДНК полимераз.
Апробация работы. Результаты исследований докладывались на семинарах в компании Promega (США), на семинарах Лаборатории Молекулярной Генетики Анаеробов ИМГ РАН и ежегодной научной конференции ИМГ РАН (1997).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание объектов и методов исследования, изложения результатов исследования и их обсуждения, а также заключения,