Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор. Противоопухолевая активность мурамилпептидов . 7
I. Противоопухолевая активность МП in vitro и in vivo.
І.І.МДПиГМДП 8
1.2. Аналоги с модифицированной N-ацетилмурамовой кислотой 9
1.3. Аналоги с заменой остатка L-аланина 10
1.4. Аналоги с модификацией остатка D-изоглутамина 10
1.5. Инкапсулированные МП 12 П. Механизм противоопухолевого действия МП 16
II. 1. Активация макрофагов 16
П.2. Увеличение активности нормальных киллеров 17
П.З.Повышение активности нейтрофилов, лимфоцитов и эндотелиальных клеток 18
П.4. Индукция биосинтеза цитокинов 19
П. 5. Прямое действие на опухолевые клетки 21
III. Применение МП в комплексной терапии 23
III. 1. Задачи комплексной терапии 23 Ш.2. Комбинация МП/химиопрепарат 24 Ш.З. Комбинация МП/цитокин 29 Ш.4. Комбинация МП/липополисахарид 35
IV. Использование МП в клинике 36
Заключение 41
ГЛАВА 2. Результаты и обсуждение
2.1. ГМДП индуцирует секрецию TNF-a, который повышает чувствительность популяции клеток меланомы BRO к восприятию сигнала ГМДП 43
2.2. TNF-a увеличивает число сайтов специфического связывания ГМДП на клетках меланомы BRO 49
2.3. Демаскирование как механизм увеличения числа сайтов специфического связывания ГМДП на поверхности клеток меланомы BRO 56
2.4. Влияние ГМДП и TNF-a на жизнеспособность клеток TNFa-резистентных и TNFa-чувствительных клеточных линий in vitro
2 2.4.1. Влияние ГМДП на цитотоксическое действие rNF-a в отношении клеток линии L929 61
2.4.2. Цитотоксическое действие аналогов ГМДП и Акт D, на клетки линии L929 66
2.4.3. Влияние ГМДП на цитотоксический эффект цисплатина и доксорубицина в отношении клеток линии L929 66
2.4.4. Влияние ГМДП на цитотоксическое действие комбинаций rNF-a с цитостатиками проявленное в отношении клеток линии L929 68
2.4.5. Влияние аналогов ГМДП на цитотоксический эффект TNF-a в присутствии актиномицина D в отношении клеток линии L929 70
2.4.6. Влияние ГМДП на цитотоксический эффект комбинаций цисплатин /TNF-a и доксорубицин /TNF-a в отношении клеток линии L929 71
2.4.7. Влияние комбинаций ГМДП, цисплатина и TNF-a на жизнеспособность трансформированных клеток TNFa-чувствительных линий человека и мыши 73
2.4.8. Влияние ГМДП и TNF-a на жизнеспособность TNF-a-резистентных клеточных линий in vitro 76
2.4.9. Влияние комбинаций препаратов ГМДП, rNF-a и цисплатина на опухолевые клетки онкологических больных 76
2.4.10. Влияние комбинаций препаратов ГМДП, цисплатин и TNF-a на нормальные клетки 82
2.4.11. Влияние комбинаций препаратов ГМДП, доксорубицин и TNF-a на жизнеспособность нормальных клеток и трансформированных клеток TNF-a-чувствительных линий человека и мыши 85
ГЛАВА 3. Экспериментальная часть 88
Выводы 97
Список литературы
- Аналоги с заменой остатка L-аланина
- Прямое действие на опухолевые клетки
- Демаскирование как механизм увеличения числа сайтов специфического связывания ГМДП на поверхности клеток меланомы BRO
- Влияние аналогов ГМДП на цитотоксический эффект TNF-a в присутствии актиномицина D в отношении клеток линии L929
Аналоги с заменой остатка L-аланина
Показано, что МП действуют на макрофаги непосредственно [16, 72, 73]. Например, при изучении ингибирующего влияния МТП-ФЭ на развитие метастазов меланомы B16-BL6 у мышей сингенной линии C57BL/6N методами иммунофлуоресцентного и электрономикроскопического анализа было показано, что через 24 часа после введения МТП-ФЭ альвеолярные и ассоциированные с метастазами макрофаги содержали фагоцитированные липосомы с мурамилпептидом, причем только макрофаги, содержащие мурамилпептид, обладали in vitro цитотоксической активностью против клеток данной опухоли [74].
Убедительные доказательства того, противоопухолевая активность МП опосредуется макрофагами, приводятся в сообщении Phillips и Tsao [16]. МДП и Л-МДП-ГДП индуцировали in vitro цитотоксическую активность макрофагов и клеток Купфера против клеток ретикулярной саркомы М5076. Эти препараты также ингибировали рост в печени метастазов саркомы М5076 мышей линии C57BL/6. Адоптивный перенос активированных макрофагов приводил к ингибированию роста метастазов в печени мышей-реципиентов, в то время как интактные макрофаги не ингибировали рост метастазов. Если в липосомы вместе с МДП-ГДП инкапсулировали антимакрофагальный токсин - дихлордиметилендифосфонат, то такие липосомы теряли как способность индуцировать in vitro цитотоксическую активность макрофагов, так и способность ингибировать рост метастазов in vivo [16].
Важно отметить, что под влиянием МП активированные макрофаги специфически разрушают опухолевые клетки, не разрушая при этом нормальные клетки. Например, при обработке моноцитов периферической крови здоровых доноров in vitro липосомами с МТП-ФЭ или чистыми липосомами было показано, что моноциты, которые содержали эндосомы с МТП-ФЭ, лизировали клетки трех различных трансформированных клеточных линий и не лизировали нормальные клетки двух переживающих культур [53]. Smith et al [75] регистрировали повышение цитостатического эффекта фракции прилипающих клеток крови собак, состоящей из 42% моноцитов, 49% лимфоцитов и 8% эозинофилов, которым был внутривенно введен липофильный аналог МДП (Л-МТП-ФЭ), в отношении клеток остеосаркомы D-17 собак, а также клеток меланомы A3 7 5 человека.
Известно, что прогрессирующая опухоль супрессирует иммунную систему. В связи с этим большой интерес вызывают результаты исследований, в которых МП проявляли способность восстанавливать функциональную активность клеток иммунной системы. Было показано, что МП могут восстановить противоопухолевую активность макрофагов, активность нормальных киллеров, подвижность лимфоцитов. Например, Sone et al [76] показали, что супрессия функциональной активности моноцитов, выделенных из крови онкологических больных с раком легких, проявлялась, в частности, в том, что спонтанная цитотоксичность моноцитов пациентов по отношению к аллогенным меланомным клеткам A3 75 была существенно ниже, чем цитотоксичность моноцитов здоровых доноров. Л-МТП-ФЭ и свободный МДП усиливали цитотоксичность моноцитов раковых больных. Интересно, что МТП-ФЭ активировал в равной степени моноциты онкологических больных и моноциты здоровых доноров, в то время как МДП активировал моноциты пациентов с раком легких менее выражено, чем моноциты здоровых доноров.
Активированные МДП и мурамоилтрипептид-холестерином крысиные альвеолярные макрофаги усиливали синтез индуцированной NO-синтетазы и, соответственно секрецию N0. Оксид азота опосредовал в значительной степени цитотоксическую активность макрофагов по отношению к крысиным опухолевым клеткам Р77 [56].
Наряду с активацией моноцитов и макрофагов in vivo и in vitro МП увеличивают активность нормальных киллеров (NK-клеток). NK-клетки - один из барьеров на пути опухолевого роста. Было показано, что МТП-ФЭ увеличивает активность нормальных киллеров in vivo, причем он увеличивал активность NK-клеток в легких и печени и не увеличивал в периферической крови и в перитонеальной полости [77]. Противоречивые данные опубликованы относительно влияния МТП-ФЭ на активность NK-клеток в селезенке [42, 77]. Полагают, что в механизме индукции МП цитотоксической активности NK-клеток задействованы цитокины [77].
Аналог МДП, Ы8-МДП(А1а), активировал in vitro нормальные киллеры, выделенные з селезенки и из периферической крови здоровых или несущих Ab (amelanotic) Bomirski меланому хомяков. Степень активации NK-клеток здоровых и несущих меланому хомяков іависела от начального уровня цитотоксичности нормальных киллеров: чем выше был ісходньш уровень цитотоксичности, тем менее выражена была активация. Наибольший эффект МП стимуляции отличал NK-клетки, выделенные из селезенки и из периферической крови хомяков через 10-12 дней после трансплантации меланомы. Было отмечено, что NK-клетки, взятые у хомяков в разные сроки после трансплантации Ab Bomirski меланомы, при активации МП in vitro проявляли цитотоксическую активность не только по отношению к клеткам Ab Bomirski меланомы, но и по отношению клеток эритролейкоза человека К562 [78].
Процесс активации МП NK-клеток не является решающим в проявлении противоопухолевой активности МП. В ряде случаев было показано, что угнетение роста опухоли активными аналогами МП не сопровождается активацией NK-клеток. Например, Sakita et al [79] показали, что Л-МДП не влиял на активность NK-клеток перитонеальной полости, однако подавлял рост асцитной опухоли МН134 в СЗН/Не мышах и вызывал существенное продление их жизни.
Тем не менее цитотоксическая активность NK-клеток в противоопухолевом действии МП бывает значима. Так Dinney et al [42] показали, что у мышей с сингенной метастазирующей почечной аденокарциномой цитотоксическая активность нормальных киллеров в селезенке была подавлена, а систематическое введение МТП-ФЭ восстанавливало активность этих клеток. Восстановление активности нормальных киллеров коррелировало с регрессией легочных метастазов.
Показано, что под влиянием МП активируются нейтрофилы [67, 68]. Через 8-48 часов после введения крысам МТП-ФЭ интраназально или интратрахеально в альвеолах легких было обнаружены многочисленные нейтрофилы, обладающие значительной цитотоксической и цитостатической активностью.
МП могут восстанавливать подвижность лимфоцитов, инфильтрующих опухоль. Было показано, что у пациентов с меланомой и почечной карциномой лимфоциты, инфильтрующие опухоль, катастрофически теряют подвижность. Потеря подвижности, в частности, была связана с воздействием опухолевых клеток на инфильтрующие опухоль лимфоциты, причем клетки меланомы оказывали больший ингибирующий эффект на подвижность лимфоцитов, чем клетки почечной карциномы. Подвижность оценивали в тесте in vitro, сравнивая расстояние, пройденное в коллагеновом геле инфильтрующими опухоль лимфоцитами и лимфоцитами периферической крови здоровых доноров. Было показано, что обработка Л-МТП-ФЭ восстановливала подвижность инфильтрующих опухоль лимфоцитов у 4 из 5 пациентов с меланомой. Также Л-МТП-ФЭ после первого месяца МП-терапии увеличивал подвижность лимфоцитов периферической крови у 6 из 7 пациентов [73].
-19 МДП и МДП-ГДП при непосредственном действии на эндотелиальные клетки повышали их противоопухолевую активность. МП увеличивали связывание клеток опухоли с эндотелиальными клетками, а также индуцировали их цитотоксическую активность в отношение сингенных клеток меланомы B16-BL6 in vitro. Свободный МДП стимулировал связывание эндотелиальных клеток с клетками опухоли в концентрации 10-100 мкг/мл, в то время как Л-МДП и Л-МДП-ГДП - при концентрации 0.01-1 мкг/мл. Следует отметить, что механизм цитотоксического действия эндотелиальных клеток являлся NO-независимым. Свободный и липосомальный МДП не изменяли активность NO-синтетазы [49].
Прямое действие на опухолевые клетки
Эффект, вызываемый вторичным добавлением ГМДП полностью отменялся при замене культуральной среды от клеток после первичного добавления ГМДП на свежую. Более того, внесение этой среды в культуру клеток меланомы BRO, первично не обработанных ГМДП, совместно с ГМДП в оптимальной концентрации для вторичного добавления (28 мкМ, 20 мкг/мл) индуцировало тот же уровень экспрессии МАА, что и последовательное двукратное добавление мурамоилпептида. Важно отметить, что наблюдаемые эффекты регистрировались только со средой от клеток, культивируемых в присутствии ГМДП не менее 24 часов, причем среда от клеток меланомы, могла активировать не только клетки меланомы, но и клетки аденокарциномы (А-549 или ACL) и наоборот.
На основании этого, было сделано предположение, что в культуральной среде клеток, обработанных ГМДП, происходит накопление цитокина, придающего неотвечающим клеткам культуры чувствительность к ГМДП.
Дальнейшая работа, в основном, проводилась на пассируемой in vitro линии клеток человека меланомы BRO. Следует отметить, что пассированием в иммунодефицитных мышах nude и beige-nude было получено две сублинии меланомы BRO с высокой и низкой метастазирующей активностью, причем сублиния с высокой метастазирующей активностью была адаптирована к росту in vitro [174].
С целью идентификации фактора был использован метод нейтрализации 5иологической активности моноклональными антителами (МА) к некоторым известным цитокинам: TGF-p, IL-ip, TNF-a (рис. 2). Нейтрализация активности наблюдалась только при использовании МА к TNF-a, причем концентрация антител 0.32 мкг/мл (разведение 1:5) приводила к полному ингибированию активности цитокина, т.е. не наблюдалось увеличение экспрессии ОАА через 24 часа после вторичного добавления ГМДП к клеткам меланомы.
Нейтрализация цитокина, содержащегося в культуральной среде активированных ГМДП клеток меланомы BRO, МА к TNF-a, IL-ip и TGF-P. МА были добавлены к культурам меланомных клеток через 24 часа после первичного добавления ГМДП. После часовой инкубации с МА в культуры была внесена вторая порция ГМДП и инкубация продолжалась еще 24 часа. Число МСА-С1-позитивных клеток (%) оценивали методом проточной цитофлуориметрии. Ингибирование определяли по формуле / = — -100%, где «А» - % МСА-С1-позитивных клеток в культурах без МА, «В» - % МСА-С1-позитивных клеток в культурах с МА.
Подтверждением наличия в культуральной среде от индуцированных ГМДП клеток TNF-a, стали результаты, полученные при биологическом тестировании препарата клеточного супернатанта на TNF-a чувствительной линии клеток L929 (рис. 3). Как видно из представленных данных, в присутствии культуральной среды от ГМДП-стимулированных клеток имела место дозозависимая гибель клеток L929. Концентрация TNF-a в среде составила 100 ед./мл.
Биологическое тестирование фактора из культуральной среды активированных ГМДП клеток меланомы на TNF-a чувствительной линии клеток L929. а - культуральная среда от интактных клеток меланомы BRO (контроль); b - культуральная среда от клеток, стимулированных ГМДП (0.14 мкМ, 24 часа); с - rNF-a. Жизнеспособность определяли в тесте с МТТ.
Еще одно подтверждение идентичности исследуемого фактора и TNF-a было получено в экспериментах с использованием экзогенного рекомбинантного TNF-a (rNF-a). rNF-a вводили в культуру клеток меланомы совместно с ГМДП, взятым в оптимальной концентрации для вторичного введения (28 мкМ). Экспрессию ОАА регистрировали через 24 часа. Результаты представлены на рис. 4. Было показано, что в сочетании с rNF-a в оптимальной дозе (100 ед./мл) ГМДП полностью воспроизводит изменения экспрессии ОАА, индуцируемые двукратным введением мурамоилпептида в культуру клеток меланомы.
Влияние rNF-а и ГМДП на экспрессию МАА МСА-С1 при праймировании клеток меланомы BRO к действию ГМДП. А - клетки в интактной культуре; В - клетки, инкубированные с 28 мкМ ГМДП; остальные - культуры, обработанные rNF-a, белые столбцы - одним rNF-a, черные - rNF-a с ГМДП.
Вышеизложенные данные позволили сделать вывод о том, что в культуральной среде клеток меланомы BRO под действием ГМДП накапливается TNF-a, который праймирует клетки к ответу на повторное введение в культуру мурамоилпептида.
Причиной появления TNF-a в культуральной среде была индуцированная ГМДП секреция цитокина, так как в культуральной среде интактных клеток TNF-a не обнаруживался.
Факт обнаружения в культуральной среде опухолевых клеток TNF-a в настоящее время уже не представляется парадоксальным. Хотя, с одной стороны, описано цитотоксическое и цитостатическое действие TNF-a на многие трансформированные клетки с in vitro [160, 161] а его регрессирующее действие на некоторые виды опухолей [123, 175-177], что дает эснование для использования TNF-a в клинической онкологии, с другой стороны известно, тто ряд трансформированных клеток продуцируют TNF-a. Так, Sander и Boyrid [178] токазали, что 12 из 17 первичных меланом экспрессируют TNF-a. У некоторых грансформированных клеток, например клеток нейробластомы, TNF-a играет роль аутокринного и паракринного фактора роста [179, 180]. Клетки трансформированных линий, іродуцирующие TNF-a, как правило устойчивы к его цитотоксическому действию (имеется $ виду цитотоксическое действие одного TNF-a, без дополнительного потенцирования цитостатиком или другим агентом) [181-183]. Следует отметить, что клетки меланомы BRO также резистентны к цитотоксическому действию TNF-a [184]. In vivo в ряде случаев экспрессия TNF-a коррелирует с увеличением метастатического потенциала опухолевых клеток. TNF-a индуцирует на клетках эндотелия сосудов экспрессию молекул адгезии ICAM-1 и VCAM, которые связываются с р2-интегрином опухолевых клеток, в результате чего опухолевые клетки инвазируют и образуют метастазы [185-187]. В некоторых случаях экспрессия TNF-a, наоборот, коррелирует со снижением скорости роста опухоли и падением уровня метастазироавния, что может быть связано с локальной активацией противоопухолевой защиты хозяина [188].
Известно, что биосинтез TNF-a моноцитами/макрофагами человека включает несколько стадий: при трансляции образуется 26-кДа трансмембранный предшественик, который затем в процессе протеолиза теряет N-концевой "лидерный" пептид и переходит в свободную форму - 17 кДа субъединицу. Протеолиз осуществляет специфическая металлопротеиназа - TNF-a конвертирующий фермент (ТАСЕ) [189]. В связи с этим было проверено, несут ли клетки меланомы BRO мембраносвязанный TNF-a и как влияет на экспрессию цитокина ГМДП. Данные, полученные методом проточной цитофлуориметрии (рис. 5), позволили заключить, что в интактной популяции около 30% клеток несут на своей поверхности TNF-a. Под действием ГМДП наблюдалось снижение уровня экспрессии TNF-a (уменьшались число клеток, несущих TNF-a, и плотность цитокина на клеточной поверхности): через 24 часа после введения мурамоилпептида TNF-a на клетках не обнаруживался. Именно этот временной интервал был необходим, как следует из вышеприведенных результатов для регистрации максимального количества TNF-a в культуральной среде. Расчеты показывают, что сброс мембраносвязанного TNF-a не может обеспечить наблюдаемую концентрацию цитокина (100 ед./мл). Очевидно, что стимуляция ГМДП приводит к синтезу TNF-a de novo или выходу его из внутриклеточного депо.
Демаскирование как механизм увеличения числа сайтов специфического связывания ГМДП на поверхности клеток меланомы BRO
Таким образом, все три теста определения выявляют общие закономерности влияния ГМДП на цитотоксическую активность TNF-a, это позволило нам в дальнейшем для решения поставленных задач использовать МТТ-тест, как наименее трудоемкий и быстрый.
Известно, что цитотоксическая активность TNF-a по отношению к опухолевым клеткам in vitro в ряде случаев коррелирует с подавлением роста соответствующей опухоли при введении экзогенного TNF-a in vivo [206, 207]. Та же закономерность отмечается при использовании in vitro и in vivo комбинаций TNF-a/цитостатик [206, 208]. Цитотоксическая активность TNF-a in vitro усиливается рядом цитостатиков [135, 166, 209]. Наиболее известным из цитостатиков, усиливающих цитотоксическое действие TNF-a, является актиномицин D (Акт D) [160, 163]. В клинике обычно применяют не монотерапию TNF-a, а его комбинации с цитостатиками [210, 211]. Полученные нами результаты позволили предположить, что ГМДП будет потенцировать цитотоксическое действие комбинации TNF-a/цитостатик. В связи с этим в следующей серии экспериментов был изучен вклад ГМДП в цитотоксическое действие комбинации TNF-a/Акт D in vitro.
Акт D в концентрациях, которые потенцирует цитотоксическую активность TNF-a (0.5-1 мкг/мл), также как ГМДП, не оказывал влияния на жизнеспособность клеток линии L929. Однако их совместное действие (48 часов инкубации) приводило к падению жизнеспособности клеток, причем, эффективность действия зависела от концентрации ГМДП. При увеличении концентрации ГМДП от 0.04 до 25 мкг/мл цитотоксический эффект комбинации ГМДП/Акт D возрастал от 10.5 до 33%.
Биологически активные мурамилпептиды (МДП и ГМДП-стеароил-лизин), также как и ГМДП, при совместном действии с Акт D индуцировали падение жизнеспособности клеток линии L929, при этом одинаковая эффективность действия достигалась при использовании равных концентраций МДП и ГМДП. ГМДП-стеароил-лизин был активен в тех же концентрациях, что и ГМДП, но оказываемый им эффект был выше (р 0.05). LL-аналог (0.1-25 мкг/мл), М-ацетилглюкозаминил-рі- 4-К-ацетилмурамовая кислота (0.1-25 мкг/мл) и аланил-Б-изоглутамин (0.1-25 мкг/мл) при совместном действии с Акт D не вызывали падения жизнеспособности клеток линии L929.
В литературе приводятся данные, свидетельствующие об успешном применении в лечении онкологических больных Акт D [212] и Акт D совместно с TNF-a [213, 214]. Однако широкое применение Акт D в онкологии ограничивается тяжелыми побочными реакциями. Значительно лучше зарекомендовали себя цисплатин [215], доксорубицин [216, 217] и комбинации TNF-a/цисплатин [218, 219], TNF-a/доксорубицин [219, 220]. Цисплатин и доксорубицин также успешно использовали с Л-МТП-ФЭ при лечении остеосарком и гемангиом у собак [52, 93, 113]. Следует отметить, что использование комбинации Л-МТП-ФЭ/цисплатин приводило к существенному увеличению периода ремиссии и продолжительности жизни собак с остеосаркомой по сравнению с монотерапией Л-МТП-ФЭ или цисплатином в том случае, когда курс МП-терапии проводили после завершения курса цисплатина. При одновременном проведении МП- и цисплатин-терапии клинические показатели соответствовали таковьм при цисплатин-монотерапии. Комплексная терапия Л-МТП-ФЭ/доксорубицин при одновременном проведении курса МП-терапии приводила к значительному увеличению периода ремиссии и продолжительности жизни собак с гемангиомами по сравнению с применением препаратов МП и доксорубицин порознь. Авторы полагают, что эффективность МП в комплексной терапии определяется его способностью снижать побочные эффекты цитостатиков, восстанавливать иммунную систему, индуцировать противоопухолевую активность моноцитов [62, 113, 121, 122].
Мы предположили, что, как в случае Акт D, ГМДП может потенцировать цитотоксическое действие цисплатина и доксорубицина на опухолевые клетки. Действительно, эксперименты показали (табл. 8 и рис. 12), что ГМДП повышает эффективность этих препаратов.
Цисплатин в концентрации 1-25 мкМ (тест с МТТ, табл. 9) оказывал цитотоксическое действие на клетки линии L929 дозозависимым образом. В присутствии ГМДП (0.1-10 мкг/мл) для достижения того же цитотоксического эффекта требовались в 2-3 раза более низкие концентрации цисплатина. Следует отметить, что ГМДП дозозависимый образом влиял на цитотоксичность цисплатина.
Указана цитотоксичность (%) комбинаций препаратов, оцениваемая как относительное снижение жизнеспособности клеток в культуре, обработанной препаратами, по сравнению с контрольной культурой. Представлены средние значения из 3-х экспериментов. - достоверность различий с аналогичной пробой без ГМДП. Время инкубации 48 часов.
Доксорубицин в интервале концентраций 0.1-30 мкг/мл в тесте с МТТ оказывал дозозависимое цитотоксическое действие на клетки линии L929 (рис. 12). При концентрации доксорубицина 100 мкг/мл кривая выходила на насыщение. Совместно с ГМДП, в концентрации 1 мкг/мл, доксорубицин вызывал еще большее снижение жизнеспособности клеток. При этом, для достижения того же цитотоксического эффекта в присутствии ГМДП требовались в 2 раза более низкие концентрации доксорубицина.
Известно, что Акт D снижает эффективную дозу (ED50) rNF-a в отношении клеток линии L929 более чем в 10 раз [160, 163]. По нашим данным введение TNF-a в концентрации 5000 ед./мл в культуру индуцировало 50%-ное падение жизнеспособности клеток. Этот уровень цитотоксического эффекта достигался через 48 часов инкубации с цитокином. При 24-часовой инкубации с TNF-a падение жизнеспособности клеток не превышало 20% уровень (рис. 13). В присутствии 1 мкг/мл Акт D 50%-ное падение жизнеспособности клеток достигалось при концентрации 5 ед./мл rNF-a, 100% - при концентрации 500 ед./мл rNF-a, причем, эти эффекты выявлялись после 18-24 часовой инкубации клеток с rNF-a/Акт D .
Влияние аналогов ГМДП на цитотоксический эффект TNF-a в присутствии актиномицина D в отношении клеток линии L929
Анализ связывания nVmil-Lys(Ftc) с клетками меланомы проводили как было іредложено ранее [154]. Клетки, интактные или обработанные rNF-a или трипсином, )Сторожно снимали резиновым скребком с поверхности лунок 24-луночного планшета, трижды отмывали центрифугированием при 300g в течение 10 мин при 4С. Для шределения общего связывания полученную клеточную суспензию (2x10 клеток на пробу) шкубировали с 2 мкг rMfln-Lys(Ftc) в 100 мкл PBS/FCS с 0.01% азида Na при 4С в течение 30 мин в темноте. После инкубации клетки трижды отмывали в PBS/FCS, суспендировали в 1 мл буфера и анализировали на цитофлуориметре EPICS "Elite" (Coulter, :іПА).
Параллельно с определением общего связывания тестировали уровень їеспецифического связывания. Для этого в пробу одновременно с rMfln-Lys(Ftc) вносили земеченый ГМДП в концентрациях в 1000, 500 раз превышающих концентрацию меченого троизводного. Величину специфического связывания определяли как разность между общим а неспецифическим связыванием.
Гашение флуоресценции проводили согласно [155]. Клетки были обработаны ГМДП-Ьуз с) (см. выше). Несвязавшуюся метку отмывали PBS/FCS, клетки переводили в 3.013 М цитратный буфер (рН 4.5), затем для определения уровня внутриклеточного связывания проводили гашение поверхностной флуоресценции, инкубируя клетки 30 секунд : 0.04% трипановым синим. Пробы отмывали нитратным буфером, суспендировали в 0.5 мл эуфера и анализировали на цитофлуориметре. Все процедуры проводили при 4С. Параллельно тестировали уровень общего связывания, заменяя для контрольных клеток инкубацию с трипановым синим инкубацией в цитратном буфере.
Освобождение экссудата из плевральной полости опухолевых больных от эритроцитов. Для получения суспензии клеток с большей плотностью клетки экссудата центрифугированием при 300g и осадок ресуспендировали в объеме в 10 раз іеньше первоначального. Полученную суспензию (по 7 мл) осторожно наслаивали на гамфоцит разделяющую среду (фиколл/диатризоат с плотностью 1.077 г/мл), разлитую по 4 /т в 15-ти мл центрифужные пробирки. Затем 25 мин центрифугировали при 600g и сомнатной температуре. Эритроциты оседали, а опухолевые клетки и лейкоциты оставались І интерфазе. Интерфазу собирали, отмывали 2 раза культуральной средой без FCS, гентрифугируя при 300g 10 мин. Затем клетки суспендировали в среде RPMI-1640 с 10% 7CS в плотности 2x105 клеток/мл и помещали по 100 мкл в ячейки 96-луночного планшета іля определения их чувствительности к цитотоксическому действию препаратов.
Изучение влияния препаратов на жизнеспособность опухолевых клеток школогических больных. Освобожденные от эритроцитов суспензии клеток в RPMI-1640 ; 10% FCS помещали по 2x104 клеток/лунку в ячейки 96-луночного планшета. После 24-х часовой инкубации были добавлены препараты TNF-a в дозе 500 ед./мл, ГМДП в концентрации 1 мкг/мл, цисплатин в интервале концентраций 1-Ю мкМ или 0.3-30 мкМ. Клетки инкубировали с препаратами в течение 24 или 72 часов. Жизнеспособность определяли в тесте с МТТ или с трипановым синим.
Изучение влияния препаратов на жизнеспособность лейкоцитов периферической крови. Кровь здорового донора была разбавлена в 4 раза 0.017 М Na-цитратным буфером, рН 7.0. Клеточная суспензия была освобождена от эритроцитов на градиенте плотности фиколл/диатризоат также как экссудат из плевральной полости онкологических больных. Отмытые лейкоциты суспендировали в среде RPMI-1640 с 10% FCS в плотности 2x105 клеток/мл и помещали по 100 мкл в ячейки 96-луночного планшета. После 24-х часовой инкубации были добавлены препараты TNF-a в дозе 500 ед./мл, ГМДП в концентрации 1 мкг/мл, цисплатин в интервале концентраций от 1 до 10 мкМ или доксорубицин 1-4 мкг/мл. Клетки инкубировали с препаратами в течение 48-ми часов. Жизнеспособность определяли в тесте с МТТ или с трипановым синим.
Изучение влияния препаратов на жизнеспособность нормальных эмбриональных фибробластов человека. Эмбриональные фибробласты, помещенные в ячейки 96-луночного планшета 2x104 клеток/мл, были получены из института Гамалеи. После 24-х часовой инкубации были добавлены препараты TNF-a в дозе 500 ед./мл, ГМДП в концентрации 1 мкг/мл, цисплатин в интервале концентраций от 1 до 10 мкМ или доксорубицин 1-4 мкг/мл. Клетки инкубировали с препаратами в течение 48-ми часов. Жизнеспособность определяли в тесте с МТТ или с трипановым синим.
Оценка жизнеспособности клеток в тесте с МТТ. Клетки (2-4x104 кл./лунку) в 100 мкл соответствующей культуральной среды с FCS помещали в 96-луночный планшет. На ледующий день были добавлены тестируемые препараты в PBS 30 мкл/лунку и объем [робы был доведен культуральной средой до 200 мкл. Инкубация продолжалась в течение 14-120 часов в атмосфере 5% ССЬ при 37С. По окончании инкубации МТТ растворяли в BS (5 мг/мл), фильтровали и добавляли по 10 мкл в каждую лунку 96-луночного планшета, юсле чего культуры клеток инкубировали при 37С 2.5 часа. Супернатант удаляли. При аботе с суспензионными культурами (U929, карцинома Эрлиха EAT, клетки школогических больных, PBL) для избежания потери клеток перед удалением ;упернатантов планшеты центрифугировали при 300g в течение 10 мин. Затем в лунки добавляли по 100 мкл ДМСО и суспендировали для растворения образовавшихся кристаллов. Экстинкцию измеряли при 540 нм на спектрофотометре Titertek Multiskan МСС/340.
Процент цитотоксичности определяли по формуле Zf = =MO0% «А» - показатель экстинкции в контроле (в образце, в который вместо препаратов вносили PBS), «В» - показатель экстинкции в образце, обработанном препаратами.
Оценка жизнеспособности клеток в тесте с кристаллическим фиолетовым. Клетки (2-4x104 кл./лунку) в 100 мкл соответствующей культуральной среды с FCS помещали в 96-луночный планшет. На следующий день были добавлены тестируемые препараты в PBS 30 мкл/лунку и объем пробы был доведен культуральной средой до 200 мкл. Инкубация продолжалась в течение 48 часов в атмосфере 5% СОг при 37С. Затем среду убирали, клетки промывали 3 раза PBS, фиксировали в смеси метанол/уксусная кислота 3/1 в течение 20 мин, и окрашивали 0.5% раствором кристаллического фиолетового в 20% метаноле в течение 20 мин. Ячейки планшета были отмыты 7 раз водой и высушены. Краситель, связавшийся с клетками, растворяли в 1% SDS и уровень его поглощения при 540 нм измеряли на спектрофотометре Titertek Multiskan МСС/340. Процент цитотоксичности определяли по формуле Z[ = =M0O% «А» - показатель экстинкции в контроле (в образце, в который вместо препаратов вносили PBS), «В» - показатель экстинкции в образце, обработанном препаратами. Оценка жизнеспособности клеток в клоногенном тесте [156, 157]. Клетки линии L929 были посажены в 8.8 см2 культуральные чашки 400-500 клеток/чашку в 1 мл RPMI-1640 с 10% FCS. На следующий день были добавлены тестируемые препараты в PBS 30 мкл/чашку. Инкубация продолжалась в течение 7 дней в атмосфере 5% СОг при 37С. Затем -96 реду убирали, клетки промывали 3 раза PBS, фиксировали и окрашивали как в тесте с ;ристаллическим фиолетовым. Подсчет окрашенных колоний производили визуально. Троцент цитотоксичности определяли по формуле Ц = -100% «А» - число колоний в контроле (в чашке, в которую вместо препаратов вносили PBS), «В» -гасло колоний в образце, обработанном препаратами.
Оценка жизнеспособности клеток с трипановым синим. Инкубацию с препаратами іроводили как в тесте с МТТ. По окончании инкубации клетки были сняты резиновым жребком промыты 2 раза средой без сыворотки. Снятые клетки и смывы были объединены в эдин образец. Из образца отбирали аликвоту 50 мкл добавляли к ней 10 мкл 0.4% раствора грипанового синего и сразу помещали в камеру Горяева для подсчета живых и мертвых клеток (мертвые клетки в отличие от живых включали краску). При этом считали не менее 100 клеток. Процент цитотоксичности определяли по число мертвых клеток в образце, «В» - общее число клеток.
