Введение к работе
Актуальность темы. Одной из наиболее важных задач молекулярной биологии является изучение механизмов выражения генетической информации. Шрвый этап этого процесса - синтез РНК на матрице ДНК - осуществляется ДНК-зависимыми РНК-полимеразами ; (рибонуклеозид 5'-трифосфат: РНК-нуклеотидилтрансферазами, Ш. 2. 7. 7. б.). Как правило, эти ферменты являются сложными олиго-мерными бедками. Для понимания механизмов их работы необходимы исследования функций отдельных субъединиц, выделение в них функциональных доменов.
Наилучшей моделью для исследования структуры и функций ' этого фермента является РНК-полимераза кишечной палочки (Escherichia coll), состоящая из четырех основных (2А,р,^,) и одной регуляторной (6) субъединицы. Для наиболее просто устроенной бактериальной системы легче всего реализовать подходы, позволяющие получать направленные мутации в генах субъединиц РНК-полимеразы» и исследовать проявление этих мутаций in vitro.
Дель и задачи исследования. Цель» работы являлось исследование структурно-функциональной организации ji-субъединицы РНК-полимеразы Е.coll методами инсёрционно-делеционного и точечного мутагенеза. В работе ставились следующие аадачи. Раз- . работать систему регулируемого синтеза^ -субъединицы под контролем лактозного промотора в составе плазмиды для отбора в ней доминантно-летальных мутаций. Получить набор инсерционных и делеционных мутаций в соответствующим гене (гроВ). Генетически и биохимически охарактеризовать полученные мутации и определить функцию, нарушаемую мутацией. Получить точечные мутации в районе предполагаемого активного центра РНК-полимераза По данный мутагенеза построить структурно-функциональную карту /1-субъединицы.
Научная новизна и практическая ценность. Впервые проведе- _. но детальное картирование ^-субъединицы РНК-полимеразы E.ooli с помощью инсёрционно-делеционного мутагенеза. Сконструирована система для получения летальных мутаций в жизненно-важном гене jb-субъединицы. Впервые получены мутации, нарушающие ферментативную активность РНК-полимеразы. Получена информация о районах.не существенных для функционирования исследуемой субъединицы.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на еие-годной научной конференции ИЫГ АН СССР в 1990 году, на сиыпо-
- г -
аиуме по генетике бактерий и фагов в Колд-Спринг-Харборе, США в 1989 году, на семинарах в Институте молекулярной генетики АН СССР и во Всесоюзном научно-исследовательском институте, хене-тики и селекции промышленных микроорганизмов, а также опубликованы в четырех статьях.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов, списка литературы. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, включая таблиц и рисунков. Библиография включает в себя названий, в том числе русских и иностранных.