Введение к работе
Актуальность темы диссертации. Прочная взаимосвязь, существующая между функциональной активностью отдельных белков и их внутриклеточной локализацией, позволяет проводить изучение значимости отдельных элементов молекулы для функционирования белка в целом in vivo, основываясь, прежде всего, на изменениях в локализации в клетке мутантных полипептидов, детектируемых с помощью методов иммуноцитохимии или флуоресценции слитых с исследуемым продуктом белков-маркеров.
Исследование структурно-функциональных отношений в белке ядрышка эукариот - фибрилларине, позволяет выявить участки белковой молекулы, определяющие его РНК-связывающую и метилтрансферазную активности, а также установить структурные элементы, направляющие транспорт этого белка в ядрышко. Такие данные, помимо фундаментальных знаний о принципах функционирования фибрилларина и механизмах процессинга пре-рРНК, позволяют выяснить закономерности распределения фибрилларина в клетке на разных стадиях клеточного цикла, онто- и эмбриогенеза. Последнее особенно важно в связи с образованием у ряда больных аутоиммунными заболеваниями, в частности, системной склеродермией, антител к фибрилларину и его комплексам с нуклеиновыми кислотами и другими белками. Т.о. понимание закономерностей структурно-функциональной организации фибрилларина ведет к расширению знаний о возникновении и течении аутоиммунных заболеваний.
Сказанное выше и определяет актуальность темы исследования.
Цель работы. Целью работы являлось выяснение функциональной роли отдельных структурных элементов в молекуле фибрилларина человека - белка ядрышка эукариот, участвующего в процессинге прерибосомальной РНК.
Научная новизна работы. При проведении работы создана серия рекомбинантных векторов, несущих гены различных мутантных форм фибрилларина человека, слитых с маркерным зеленым флуоресцирующим
белком (GFP) под контролем истинно раннего промотора цитомегаловируса, для экспрессии рекомбинантных химерных белков в клетках высших эукариот. Изучена локализация мутантных форм фибрилларина человека в клетках HeLa.
Впервые показано, что специфическая локализация фибрилларина в фокусах транскрипции рДНК в ядрышке обусловлена не какими-либо сигнальными последовательностями, а функциональной активностью белка. Установлено, что мутантный белок, лишенный N-концевого глицин- и аргинин-богатого участка, сохраняет специфическую локализацию и, следовательно, функциональную активность, аналогично ортологам фибрилларина у Archae.
Впервые установлено, что наличие или отсутствие дисульфидной связи между двумя высококонсервативными остатками цистеина в молекуле фибрилларина человека не влияет на локализацию и функциональную активность белка.
Впервые получен рекомбинантный экспрессионный вектор, в составе которого клонирован ген слитого белка «стрептавидин — С-концевой фрагмент фибрилларина человека». Показано, что полученная конструкция обеспечивает достаточный уровень экспрессии химерного гена в Е. coli. Разработана система выделения, очистки и ренатурации такого рекомбинантного белка из штамма-продуцента Е. coli.
Получена антисыворотка мыши, высокоспецифично взаимодействующая с С-концевым фрагментом фибрилларина и полноразмерным фибрилларином в системах in vivo и in vitro.
Практическая ценность работы. Исследована роль отдельных элементов в структурно-функциональной организации молекулы фибрилларина человека, что позволит расширить понимание процессов созревания прерибосомальной РНК и механизмов транспорта белков в клетке.
Впервые получен штамм-продуцент слитого белка «стрептавидин - С-концевой фрагмент фибрилларина» и разработана методика выделения и очистки рекомбинантного белка. Выделение такого химерного белка позволило
получить высокоспецифичную антисыворотку, потенциально применимую как в научной практике для иммуноцитохимических исследований, так и в медицинской диагностике.
Апробация результатов и публикации. Результаты работы были доложены на трех международных научных конференциях (Италия, 2003; Украина, 2003; Россия, 2004), на межлабораторных семинарах ГосНИИгенетика. Апробация диссертации проведена на заседании секции молекулярной биологии Ученого совета ФГУП «ГосНИИгенетика». По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения,
обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения
результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы.
Диссертация изложена на страницах, иллюстрирована С*-Э рисунками и
