Содержание к диссертации
Введение
1. Список сокращений 5
2. Введение 7
2.1. Актуальность проблемы 7
2.2. Цели и задачи исследования 8
2.3. Публикации по теме диссертации 8
2.4. Вклад автора 10
2.5. Положения, выносимые на защиту 11
3. Обзор литературы 12
3.1. Молекулярные факторы вирулентности вирусов 12
3.2. Вирусные гомологи рецепторов tnf и их свойства 19
3.3. Поксвирусные ингибиторы действия интерферонов 26
3.4. Болезни, обусловленные нарушением продукции tnf и ifny 33
3.5. Препараты, ингибирующие действие tnf и ifny 54
3.5.1. Anmu-TNFпрепараты 54
3.5.2. Анти-lFNyпрепараты 60
3.6. Применение вирусных белков для лечения воспалительных и аутоиммунных состояний 63
3.6.1. Вирусные ингибиторы хемокгшов 63
3.6.2. Вирусные ингибиторы комплемента 63
3.6.3. Вирусные аналогихемокинов 64
3.6.4. Вирусные аналоги 1L-10 64
3.6.5. Вирусные ингибиторы сериновых протеаз 65
4. Материалы и методы 66
4.1. Материалы 66
4.1.1. Штаммы бактерий, линии кчеток, вирусы иплазмиды, использованные в работе 66
4.1.2. Ферменты 67
4.1.3. Цитокииы, рецепторы цитокжов, антитела к цитокинам 67
4.1.4. Программное обеспечение 68
4.1.5. Олигонуклеотидные праймеры 68
4.1.6, Буферные растворы, используемые в работе 70
4.2. Методы 70
4.2.1. Культивирование клеток 70
4.2.2. Получение рекомбинантных плазмид 70
4.2.3. Клонирование фрагмента IgGl 71
4.2.4. Получение рекомбинаптиых бакуловирусов 72
4.2.5. Аффинная очистка белков CrmB, CrmB/IgGl ulFNyBP 73
4.2.6. Получение иммунных сывороток и по.тклопальиых кроличьих антител 74
4.2.7. Дот-блот-анализ 76
4.2.8. Электрофорез и вестерн-блот-анализ 77
4.2.9. Твердофазный шшуноферментный анализ 77
4.2.10. Определение биологической активности TNF-связывающих белков 78
4.2.11. Определение биологической активности вирусных IFNyBP 79
4.2.12. Изучение действия CrmB in vivo 81
5. Результаты и обсуждение 84
5.1. Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей ifny- связывающих белков ортопоксвирусов 84
5.2. Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей tnf- связывающих белков ортопоксвирусов 85
5.3. Получение рекомбинаптиых бакуловирусов, продуцирующих mpxv-ifnybp, cpxv-crmb/igg1,varv-crmb/igg1 89
5.4. Экспрессия tnf- и іfny-связыбающих белков ортопоксвирусов в клетках насекомых линии sf21 94
5.5. Очистка рекомбинантных белков 101
5.6. Характеристика рекомбинантных varv-ifnybp и mpxv-ifnybp электофорезомивестерн-блот-анализом 101
5.7. Изучение биологической активности varv-ifnybp и mpxv-ifnybp in vitro 101
5.8. Иммунохимическая характеристика аффинноочищенных рекомбинантных crmb 105
5.8.1. Электрофоретический анализ 105
5.8.2. Вестерн-блот-анализ CrmB 107
5.8.3. ТвердофазныйИФА CrmB 113
5.9. Изучение биологической активности вирусных crmb in vitro 114
5.10. Изучение биологической активности вирусных crmb in vivo 117
5.10.1. Индукция эндотоксического шока 117
5.10.2. Изучение эффектов веедепия рекомбинаптных белков СгтВ интактным мышам и на фоне эндотоксического шока 125
5.10.3. Гистологическое изучение эффектов введениярекомбипаптного белка VARV-СгтВ интактным мышам и па фойе эндотоксического шока 127
5.11. Сравнение crmb с известными антагонистами tnf 128
Выводы 130
- Цели и задачи исследования
- Поксвирусные ингибиторы действия интерферонов
- Культивирование клеток
- Характеристика рекомбинантных varv-ifnybp и mpxv-ifnybp электофорезомивестерн-блот-анализом
Цели и задачи исследования
Целью настоящего исследования было сравнительное изучение физико-химических и биологических свойств ортопоксвируспых TNF- и IFNy-связывающих белков для оценки их терапевтического потенциала. Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи: 1. компьютерный анализ аминокислотных последовательностей TNF- и IFNy-связывающих белков ортопоксвирусов с целью выявления видоспецифических отличий и выбор белков для последующего изучения их биологических свойств; 2. получение бакуловирусов, детерминирующих синтез в клетках насекомых IFNy-связывающего белка вируса оспы обезьян и химерных иммупоадгезивиых TNF- ф связывающих белков вирусов натуральной оспы и оспы коров; 3. оптимизация экспрессии TNF- и IFNy-связывающих белков ортопоксвирусов в клетках насекомых и разработка методов их выделения; 4. сравнительное изучение физико-химических и биологических свойств рскомбинантных IFNy-связывающих белков ортопоксвирусов; 5. сравнительное изучение физико-химических, иммунохимических и биологических свойств рекомбинантных TNF-связывающих белков ортопоксвирусов; Щ 6. оценка потенциала TNF-связывающих белков ортопоксвирусов как возможных TNF-антагопистов. 2.3. Публикации по теме диссертации Статьи 1. Гилсва И.П., Рязанкин И.А., Непомнящих Т.С., Тотменин А.В., Максютов З.А., Лебедев Л.Р., Афиногенова Г.Н., Пустошилова Н.М., Щелкунов С.Н. 2005. Экспрессия генов TNF-связавающих белков ортопоксвирусов в клетках насекомых и изучение свойств рекомбинантных белков. Молекуляр. биология. 39,245-254. 2. Непомнящих Т.С.. Лебедев Л.Р., Рязанкин И.А., Поздняков С.Г., Гилева И.П., Щелкунов С.Н. 2005. Сравнительное изучение рекомбинантных интерферон-у- связывающих белков вирусов натуральной оспы и оспы обезьян. Молекуляр, биология. 39,1055-1062. t 3. Гилева И.П., Малкова Е.М,, Непомнящих Т.С.. Виноградов И.В., Лебедев Л.Р., Кочиева Г.В., Гражданцева А.А., Рябчикова Е.И., Щелкунов С.Н. 2006. Изучение действия TNF-связывающего белка вируса натуральной оспы па развитие ЛПС-индуцированного эндотоксического шока. Цитокины и воспаление. 5,44-48. Патенты 4. Непомнящих Т.С.. Гилева И.П., Рязанкин И.А., Щелкунов С.Н. Рекомбииантная плазмидиая дик pfastbac-b9rz, содержащая фрагмент генома вируса оспы обезьян, кодирующий интерферон гамма связывающий белок, и штамм бакуловируса bvb9rz, продуцирующий растворимый интерферон гамма связывающий белок вируса оспы обезьян. Рос.
Пат., справка о приоритете № 2006113756 от 21,04.2006 Тезисы конференций 5. Непомнящих Т.С., Гилева И.П., Рязанкин И.А., Тотменин А.В., Лебедев Л.Р., Агеенко В.А., Щелкунов С.Н. 2002. Экспессия ортопоксвирусных аналогов рецептора интерферона гамма в клетках насекомых. Международная научно-практическая школа-конференция «Цитокины. Воспаление. Иммунитет», Санкт-Петербург, Россия, 23-26 июня. Цитокины и воспаление. 1,23. 6. Gilcva LP., Ryazankin I.A., Maxutov Z.A., Nepomnyashchih T.S., Totmenin A.V., Lebedev L.R., Ageenko V.A., Nesterov A.E,, Shchelkunov S.N. 2002. Expression of Orthopoxvirus Analogues of tumor Necrosis Factor Receptor and Gamma-Interferon receptor inlnsects Cells. 1-st International Congress Biotechnology-state of the art and prospects of development, Moscow, Russia, 14-18 October, Abstract book, 26. 7. Gileva LP., Nepomnyashchih T.S.. Lebedev L.R., Kochneva G.V., Grazhdantsseva A., Afinogenova G.A., Baldanov N.V., Pustoshilova N.M., Shchelkunov S.N. 2004. TNF-Binding Proteins of Pathogenic Orthopoxviruses: Purification and Some Characteristics. International Conference «Chemical and Biological Problems of Proteomics», Novosibirsk, Russia, 5-9 July. Abstract book, 83. 8. Gileva I.P., Nepomnyashchih T.S., Lebedev L.R., Kochneva G.V., Grazhdantsseva A., Afinogenova G.A., Baldanov N.V., Pustoshilova N.M., Shchelkunov S.N. 2004. TNF-Binding Proteins of Human-Pathogenic Orthopoxviruses: Purification and Some Characteristics. 12th International Congress of Immunology, Monreal, Canada, 18-23 July. Abstract book. 9. Gileva LP., Nepomnyashchih T.S., Lebedev L.R., Kochneva G.V., Grazhdantsseva A., Afinogenova G.A., Baldanov N.V., Pustoshilova N.M., Shchelkunov S.N, 2004. TNF-Binding Proteins of Human-Pathogenic Orthopoxviruses: Purification and Some Characteristics. XVth International Poxvirus and Iridovirus Conference, Oxford, Great Britain, 3-8 September. Abstract book, 143. 10. Nepomnyashchih T.S., Lebedev L.R., Kochneva G.V., Grajdantceva A.A., Malkova E.M., Vinogradov I.V., Ryabchikova E.I., Ryazankin I.A., Shchelkunov S.N., Gileva I.P. 2005. Orthopoxvirus Tumor Necrosis Factor binding proteins and Gamma-Interferon binding proteins: expression, purification and some characteristics. 7th Jonh Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology. Moscow, Russia, September 5-9. Abstract book, 34. 11. Непомнящих T.C., Лебедев Л.Р., Кочнсва Г.В., Гражданцева А.А., Гилева И.П., Щелкунов С.Н, 2005. Ортопоксвирусные TNF-связывающие белки: экспрессия, очистка и некоторые свойства. Всероссийский научный симпозиум с международным участием «Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет», Новосибирск, Россия, 19-21 июля 2005. Цитокины и воспаление. 4,121. 12. Nepomnyashchih T.S., Lebedev L.R., Kochneva G.V., Grajdantceva A.A., Ryazankin I.A., Shchelkunov S.N., Gileva I.P. 2005. Orthopoxvirus Tumor Necrosis Factor binding proteins and Gamma-Interferon binding proteins: expression, purification and some characteristics. 30th FEBS Congress - 9th IUBMB Conference, Budapest, Hungary, July 2-7. FEBS Journal. 272 (si), L1-031P. 13. Nepomnyashchih T.S.. Lebedev L.R., Kochneva G.V., Grajdantceva A.A., Malkova E.M., Vinogradov I.V., Ryabchikova E.I., Ryazankin I.A., Gileva LP., Shchelkunov S.N. 2005. Comparative studies of orthopoxviral immunomodulators. Всероссийская конференция «Фундаментальные науки - медицине», Новосибирск, Россия, 4-8 сентября. Abstract book, 99. 14. Непомнящих Т.С., Плева І.П., Кочнєва Г.В., Гражданцева А.В., Малкова Є.М., Виноградов І.В., Рябчикова Є.І., Щелкунов С.Н. 2006. Вивчення властивостей рекомбинантного TNF-зв язуючого білка вірусу натуральної віспи в якості блокатора біологічної активності TNF
Научно-практическая конференция «Сепсис: проблемы диагностики, терапии и профилактики», України, Харків, 29-30 марта. Abstract book, 164. 15. Непомнящих Т,С, Гилева И.П., Лебедев Л.Р., Гражданцева А.А., Малкова Е.М., Виноградов И.В., Рябчикова Е.И., Щелкунов С.Н. 2006. Ортопоксвирусные иммуномодуляторные белки как новые средства антицитокиновой терапии. III Российская конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах сибири, дальнего востока и крайнего севера», Новосибирск, Россия, 27-29 сентября. Сборник материалов конференции, 174. 2.4. Вклад автора Автором лично осуществлен компьютерный анализ аминокислотных последовательностей; получены рекомбииаитные бакуловирусы, продуцирующие интерферон гамма связывающий белок (IFNyBP) вируса оспы обезьян (MPXV), иммуноадгезивные варианты TNF-связывающих белков (CrmB/IgGl) вирусов оспы коров (CPXV) и натуральной оспы (VARV); проведено изучение экспрессии генов TNF-связывающего белка (CrmB) VARV, CPXV-CrmB, MPXV-CrmB, VARV-CrmB/IgGl, CPXV-CrmB/IgGl, VARV-IFNyBP и MPXV-IFNyBP в линии клеток насекомых SOI; проведена характеризация рекомбинантных вирусных белков методами вестери-блот анализа и электрофореза; проведено изучение биологической активности вирусных рекомбинантных белков in vitro. Иммунизация кроликов и получение иммунных сывороток осуществлено Рязанкиным И.А. (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор») при участии автора. Очистка рекомбинантных белков методом аффинной хроматографии осуществлена Лебедевым Л.Р. (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор») при участии автора. Изучение биологической активности вирусных CrmB in vivo проводилось Гражданцевой А.А., Кочнсвой Г.В. (ФГУН ПІЦ ВБ «Вектор») при участии автора. Клонирование фрагмента иммуноглобулина (Ig) G1 осуществлено Мурашевым Б.В. (Институт особо чистых биопрепаратов, Санкт-Петербург). Характеризация рекомбинантных CrmB методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) проводилась Афиногеновой Г.Н., Пустошиловой Н.М. (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»). Гистологические исследования осуществлены Майковой Е.М., Виноградовым И.В., Рябчиковой Е.И. (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»).
Поксвирусные ингибиторы действия интерферонов
Иптсрфероны подразделяют на два типа, которые действуют через различные клеточные рецепторы. К первому типу относят IFNct, IFNp\ IFNic, IFNT, IFNM. Структурно отличный IFNy имеет функциональное подобие с описанными выше интерферонами первого класса и относится ко второму классу данных цитокинов (Samuel, 2001; Meager, 2002; Schroder et al, 2004). IFN всех типов обладают следующими эффектами; подавлением репликации вирусов, подавлением трансляции белков, в том числе вирусных, антипролиферативным действием и некоторыми другими общими иммуномодулирующими влияниями (Ярилин, 1999; Meager, 2002; Schroder et al, 2004). Иптсрфероны первого класса обладают более выраженными антивирусными свойствами по сравнению с IFNy и участвуют в неспецифическом иммунном ответе (Mossman, 2002). 1ФЫГ служит стимулятором макрофагов, снижает секреторную активность Th2, то есть он усиливает проявление клеточного иммунитета (Ярилин, 1999; Meager, 2002; Schroder et al, 2004). При вирусной инфекции клетки в ответ па двухцепочечные молекулы РНК (дцРНК), образуемые в процессе развития вируса, синтезируют IFN и секретируют его в межклеточное пространство, где он связывается со специфическими рецепторами соседних нсзараженных клеток и индуцирует антивирусное состояние этих клеток (Karupiah et al, 1993; Mossman et al, 1997; Smith et al, 1998). По крайней мере два ферментных пути определяют IFN-индуцируемое антивирусное состояние клетки. В один путь входит lFN-ипдуцируемая активируемая дцРНК протеинкииаза (PKR) (иногда называемая DAI-киназой), а во второй - 2-5А(ррр(А2 р)пА)-синтетаза (обычно называемая 2-5А-синтетаза). Протеинкииаза активируется в результате аутофосфориллирования, которое происходит после связывания фермента с дцРНК. Активированная протеинкииаза фосфориллируст сс-субъединицу эукариотического фактора инициации трансляции (eIF-2cc), ингибируя тем самым белковый синтез. Другой фермент - 2-5А-синтетаза - после активации молекулами дцРНК катализирует полимеризацию АТФ в 2 -5 -связанные олигоад єни латы, которые в свою очередь активируют латентную клеточную эндо-РНКазу L. Эта РНКаза расщепляет молекулы мРНК и рРНК, тем самым, нарушая белковый синтез (Karupiah et al., 1993; Mossman et al, 1997; Smith etal, 1998).
Ограничение индукции IFN может помогать вирусу распространяться, не давая окружающим очаг вирусного поражения клеткам становиться устойчивым к вирусной репликации. Поксвирусы для ограничения продукции IFN минимизируют формирование дцРНК на ранних стадиях инфекции, кодируют белок, связывающий дцРНК, ингибируют нротеолитическое созревание IFNy-индуцирующего фактора - интерлейкина-18 (Smith et al, 1998; Alcami and Koszinowski, 2000). Поксвирусные гены кодируются обеими цепями ДНК, и, следовательно, транскрипты с противоположных цепей могут гибридизоваться, образуя дцРНК и индуцируя синтез IFN. Однако на ранних стадиях инфекции образование дцРНК минимизировано ориентацией генов и наличием терминаторов транскрипции. Гены концевых районов генома обычно транскрибируется только с одной цепи по направлению к концам друг друга, предотвращая формирование дцРНК. В центральных районах генома гены транскрибируются с обеих цепей ДНК, и в случае направления генов на встречу друг другу транскрипционные терминирующие сигналы имеют тенденцию ограничивать раннюю транскрипцию с обеих цепей ДНК в одном и том же районе генома. Сигнал для терминации транскрипции ранних генов TTTTTNT присутствует возле конца большинства, но не всех ранних генов и его эффективность не составляет 100%. Изредка у ранних генов отсутствует такой сигнал и тогда их транскрипция ограничивается несколькими следующими ранними генами. В ситуации, когда два расположенных рядом ранних гена транскрибируются навстречу друг другу, в межгенном регионе часто имеются множественные транскрипционные терминирующие сигналы на каждой цепи ДНК (рис. 3) (Smith etal, 1998). Ортопоксвирусы, несмотря на продукцию больших количеств вирусспецифичных дцРНК на поздней стадии цикла развития, характеризуется высокой устойчивостью к действию IFN. Обнаружено, что ген E3L VACV кодирует ингибитор IFN-индуцируемой DAI-киназы (Smith et al, 1998; Moss and Shisler, 2001). Данный ранний вирусный белок с молекулярной массой 25 кДа обладает способностью связываться с молекулами дцРНК, тем самым конкурируя со специфичной протеинкиназой клетки за связывание с дцРНК и ингибируя ее активацию. Регион возле С-конца данного белка содержит мотивы, присутствующие в различных дцРНК-связывающих белках. Мутационным анализом показано, что этот регион белка требуется для связывания дцРНК и ингибирования активности киназы. Делеция 83 аминокислот N-конца данного белка не повлияла на его свойства. Рекомбипантный E3L белок, выделенный из Е. colt, связывает дцРНК с Kd 7-9 нМ и способен димеризоваться (Smith et al, 1998). Другой ранний ген VACV, K3L, кодирует гомолог elF-2a. Это белок с молекулярной массой 10.5 кДа и 28% гомологией с N-концом eIF-2a, который фосфориллируется PKR, что приводит к инактивации eIF-2a. Этот гомолог конкурирует с эндогенным eIF-2a клетки за вступление в реакцию фосфориллирования активированной протеинкиназой. Мутантный VACV с нарушенным геном K3L проявляет повышенную чувствительность к IFN, и выход вируса уменьшается на два порядка (Smith et al, 1998; Moss and Shisler, 2001). Таким образом, геном VACV содержит гены, продукты экспрессии которых двумя независимыми способами ингибируют действие IFN-индуцируемой дцРНК-акти вируєм ой протеипкиназы. Эти белки экспрессируются на ранних стадиях инфекции, a E3L не детектируется уже через три часа после инфицирования. Оба этих белка, возможно, влияют на активность 2-5А-индуцибельной РНКазы L , поскольку этот путь становиться активным в клетках, инфицированных делеционными вариантами вируса, но не в клетках, инфицированных диким вирусом (Smith et al, 1998; Moss and Shisler, 2001). Обнаружено, что ранне-поздний ген A18R VACV кодирует белок, который предотвращает индукцию 2-5А сшггетазного каскада. Недавно было показано, что этот белок контролирует раннюю и позднюю транскрипцию VACV. Другой ген, кодирующий трифосфат-фосфогидролазу-1, контролирует экспрессию ранних и поздних вирусных генов и необходим для проявления свойств устойчивости VACV к действию IFN (Smith et al, 1998). VACV кодирует ингибитор каспазы-1, фермента, необходимого для протеолитичсскои активации IL-18 (Ray et al, 1992; Kettle et al, 1997).
Также покешрусы кодируют IL-18-связывающий белок, который предотвращает связывание IL-18 с его рецептором (Alcami and Koszinowski, 2000; Moss and Shisler, 2001). Это косвенно снижает экспрессию IFNy. Поксвирусы также кодируют растворимые IFNa/p и IFNy связывающие белки, препятствующие связыванию данных цитокинов с их клеточными рецепторами (Smith et al, 1998; Alcami and Koszinowski, 2000; Moss and Shisler, 2001). Поксвирусный IFNa/pBP, кодируемый B18R геном VACV штамма WR, представляет собой секретируемый гликопротеин с молекулярной массой около 65 кДа и обладает незначительной гомологией с a-цепью мышиного, человеческого, коровьего рецептора IFN первого типа. Фактически, этот белок по гомологии последовательностей с генами хозяина является членом семейства иммуноглобулинов. Он содержит три иммуноглобулиновых домена и связывает и конкурентно ингибирует IFNa, -р\ -со различных видов млекопитающих. Деления данного гена аттенуирует вирус. Вирус эктромелии также кодирует IFNct/p-связывающий белок, который ингибирует человеческий и мышиный IFNa и человеческий IFNp (Smith е/а/., 1998). Анализ генома RPXV показал наличие гена, кодирующего протеин, обладающий значительной гомологией с клеточным рецептором IFNy (IFNyR) (Upton et al., 1992), Это было первым случаем обнаружения гомолога IFNyR у поксвирусов. Данный белок, кодируемый седьмой ОРТ и секретируемый зараженными клетками, получил название М-Т7. Он секретируется в количестве 10 молекул на клетку в час на ранней стадии инфекции (Upton et al, 1995). Он связывает IFNy (Kd 10"9 M), предотвращая его взаимодействие с клеточными рецепторами (Upton et al, 1992), аналогично растворимым человеческим и мышиным рецепторам. Впоследствии растворимые гомологи IFNyR были обнаружены у многих других поксвирусов (Mossman et al., 1995; Alcami and Smith, 1996a,b) (табл. 1). Так, родственный RPXV лепорипоксвирус Shope fibroma кодирует растворимый гомолог IFNyR, названный S7, размер которого составляет 265 а.к. (Upton and McFadden, 1986; Mossman et al, 1995).
Культивирование клеток
Клетки Sf21 культивировали в среде Грейса («Sigma», США) с добавлением 10% эмбриональной бычей сыворотки (FBS) («БиолоТ», Россия) и гентамицина (80 мкг/мл) при 28С. Клетки L929, Л-68, CV-1 и СНО культивировали в среде DMEM (ГНЦ ВБ «Вектор», Россия) с добавлением 10% FBS («БиолоТ», Россия), стрептомицина (50 мкг/мл) и пенициллина (50 единиц/мл) при 37С в СО -инкубаторе (концентрация С02 составляла 5%). Для культуральных работ использовали пластиковую посуду фирмы «Orange Scientific» (США). 4.2.2. Получение рекомбшшптных tmautud Получение рекомбинантпых плазмид проводили стандартными генно-инженерными методами, включающими в себя: получение компетентных клеток Е. coli (Sambrook et at, 1989); трансформацию компетентных клеток Е. coli (Sambrook et а!., 1989); выделение плазмидной ДНК (Sambrook et al, 1989); гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции (Sambrook et at., 1989); лигирование (Sambrook et al, 1989); электрофорез ДНК (Sambrook el al, 1989); амплификацию фрагментов вирусного генома полимеразной цепной реакцией (ПЦР) (Sambrook et al, 1989); выделение бакмидной ДНК (Baco-Bac, Instruction manual). Определение нуклеотидной последовательности проводили методом терминации синтезируемой цепи на автоматическом секвеиаторс 310 Genetic analyzer («РЕ BioSystems», США) с использованием реагента «BigDye-2» («РЕ BioSystems», США) согласно рекомендациям фирмы-изготовителя. 4.2.3. Клонирование фрагмента IgGl Геномная последовательность, включающая фрагмент гена тяжелой цепи IgGl с 216 по 443 ах, содержит два нитрона. Для получения собственно кодирующей последовательности этот геномный фрагмент, полученный методом ПЦР с использованием праймеров 1 и 2 (табл. 8), клонировали в плазмиде pcDNA3 («Invitrogen», США) по сайтам эндонуклеаз рестрикции Nhel и Xbal. Полученной плазмидой трансфецировали клетки линии СНО, Клетки линии СНО культивировали как описано выше до формирования клеточного монослоя на 75-85% поверхности лунок 6-луночного планшета. При достижении необходимой плотности клеток ростовую среду удаляли, лунки планшета промывали два раза средой DMEM, Готовили смесь для трансфекции: 1-1.5 мкг плазмидной ДНК в 100 мкл среды DMEM смешивали с раствором, содержащим 5.2 мкл трапсфекциоиного реагента «LipofectAse» («Life Technologies», США) в 100 мкл среды DMEM (расчет приведен для одной лупки) и инкубировали 20 мин при комнатной температуре.
Добавляли в трансфекционную смесь 800 мкл среды DMEM, полученный раствор вносили в лунки планшета. Планшеты инкубировали при 37С в СОг-инкубаторе. Через 5 часов трансфекционную смесь удаляли, лунки планшета промывали средой DMEM и вносили в них 2 мл DMEM с 10% FBS. Планшеты инкубировали при 37С в СОг-инкубаторе. Через 24 ч клетки промывали средой DMEM и выделяли из клеток суммарную РНК, используя реактив Trizol («GIBKO», США) согласно рекомендациям фирмы-изготовителя. Далее, используя суммарную РНК, выделенную из трансфсцированных клеток, и праймеры 3 и 4 (табл. 8), с помощью реакции обратной транскрипции получали кДНК, кодирующую фрагмент тяжелой цепи IgGl, кодирующий 216-443 а. к. Полученный таким образом фрагмент далее клонировали в плазмиде pBluescript II SK (+) («Stratagene», США). 4.2.4. Получение рекомбшшптпых бакулоеирусов 4.2.4.1. Трансфекции клеток линии Sf21 бакмидными ДНК (Baco-Bac, Instruction manual) Засевали клетки линии Sf21 в лунки шестилуночного планшета из расчета, чтобы на следующий день был монослой (2 х 106 клеток на лунку) (условия культивирования описаны выше). На следующий день ростовую среду удаляли, лунки планшета промывали два раза средой Грейса. Готовили смесь для трансфекции: 10 мкл вирусной ДНК (бакмиды) в 100 мкл среды Грейса смешивали с раствором, содержащим 6 мкл трансфекционного реагента CellFECTIN («LifeTecnologies», США) в 100 мкл среды Грейса (расчет приведен для одной лунки) и инкубировали 20 мин при комнатной температуре. Добавляли в трансфекционную смесь 800 мкл среды Грейса, полученный раствор вносили в лунки планшета. Инкубировали клетки в течение 15-18 ч при 28С, трансфекционную смесь удаляли, лунки планшета промывали средой Грейса, добавляли по 2 мл среды Грейса с 10% FBS. Инкубировали клетки при 28С 2-5 сут. Проводили три цикла замораживания - оттаивания для получения лизатов клеток. Лизаты клеток расфасовывали в пробирки. Хранили при -20С. После трансфекции полученными рекомбинантными бакмидными ДНК и векторной бакмидной ДНК линии клеток Sf21 отобрали рекомбинантные бакуловирусы BvB9RZ, BvG2RIgG и BvI4RIgG и векторный бакуловирус Bv. 4.2.4.2. Заражение клеток Sf21 бакуловирусами Клетки SF-21 культивировали до монослоя как описано выше. Размораживали полученный ранее материал. Удаляли ростовую среду, вносили вирусный материал. Инкубировали 1 ч при комнатной температуре и периодическом покачивании. Добавляли среду Грейса с 10% FBS. Инкубировали клетки при 28С 2-5 сут. Проводили три цикла замораживания - оттаивания для получения лизатов клеток. Лизаты клеток расфасовывали в пробирки. Хранили при -70С 4,2.4.3. Определение титра бакуловирусов Определение титра бакуловирусов проводили на культуре клеток в шестилуночных планшетах. Клетки SF-21 культивировали до монослоя как описано выше. Размораживали полученный ранее вирусный материал и готовили разведения вируса (1 : 10, 1 : 100, ..., 1 : 107) в 200 мкл среды Грейса. Удаляли ростовую среду из лунок планшета, в лунки вносили разведения вируса. Инкубировали 1 ч при комнатной температуре и периодическом покачивании. Готовили 2% легкоплавкую агарозу («Sigma», США) на деионизоваппой воде, расплавляли и смешивали в соотношении 1 : 1 со средой Грейса, содержащей 10% FBS. Полученную среду охлаждали в термостате до 37С и добавляли по 2 мл на лупку. После застывания добавляли 2 мл на лунку среды Грейса, содержащей 10% FBS.
Инкубировали в термостате при 28С 5 сут. Добавляли по 2 мл на лунку краску нейтральный красный (0.6% водный раствор), разведенную в среде Грейса, в соотношении 1 : 20. Инкубировали при 28С в течение 1 сут. Сливали среду с краской и подсчитывали количество бляшкообразующих едениц (БОЕ). 4,2.5. Аффинная очистка белков CrmB, CrmB/IgGl и IFNyBP Аффинную очистку CrmB проводили по методике, описанной ранее (Лебедев и др., 2001). Для приготовления аффинных сорбентов к 2 мл сефарозы CL-6B («Pharmacia», Швеция) (для очистки CrmB/IgGl) либо к 10 мл ультрагеля АсА34 («Pharmacia», Швеция) (для очистки IFNyBP) добавляли 20 мл 0.1 М раствора периодата натрия и инкубировали при 16С в течение 16 ч. Активированный гель промывали водой и добавляли 1 мг высокоочищенного препарата белка A S. aureus («Serva», Германия) (для очистки CrmB/IgGl) либо 15 мг высокоочищенного препарата hlFNy (Мирошников и др., 2005) (для очистки IFNyBP) в 50 мМ натрий-карбонатном буфере, рН 8.5. После 20 ч инкубации при 6С в раствор добавляли 20 мг (50 мг для очистки IFNyBP) боргидрида натрия, перемешивая в течение 2 ч. Сорбент последовательно промывали водой, 0.2 М раствором глицин-НС 1, рН 2.5 и уравновешивали PBS. Содержание hTNF составляло 0.8 + 0.2 мг/мл геля (Лебедев и др., 2001); белка А -0.4 + 0.1 мг/мл геля; IFNy — 0.8 + 0.2 мг/мл геля. Для аффинной очистки отбирали культуральную жидкость клеток Sf21, зараженных рекомбинантными бакуловирусами и клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 2000 g, 15 мин, 2-4С. Для уменьшения объема раствора целевые белки предварительно осаждали сульфатом аммония до 50% насыщения. После растворения осадка и диализа раствор наносили на аффинную колонку со скоростью протока жидкости 1 объем колонки/ч. Сорбент отмывали буфером, содержащим 0,2 М NaCl, и элюцию проводили 0.2 М раствором глицин-НСІ, рН 2.5, нейтрализуя раствор в собираемых фракциях 1 М раствором Трис-HCl, рН 8.8. Концентрацию полученных белков определяли по методу Бредфорд (Bradford, 1976) с использованием реагента «Bio-Rad Protein Assay» («Bio-Rad», США).
Характеристика рекомбинантных varv-ifnybp и mpxv-ifnybp электофорезомивестерн-блот-анализом
Рекомбииантные белки выделяли из культуралыюй среды с помощью аффинной хроматографии. Выход целевых белков составил из 1 л культуралыюй жидкости инфицированных клеток 0.2-0.35 мг для MPXV-CrmB, 0.4-0.6 мг для CPXV-CrmB, 0.9-1.2 мг для VARV-CrmB, 4.0-5.5 мг инфицированных клеток для CrmB/IgGl, 0.7-1.0 мг для MPXV-IFNyBP и 0.8-1.2 мг для VARV-IFNyBP. 5.6. Характеристика рекомбинантных VARV-IFNyBP и MPXV-IFNyBP электофорезом и еестери-блот-апализом Результаты электрофоре ческо го и вестерн-блот- анализов афинноочищенных препаратов рекомбинантных VARV-IFNyBP и MPXV-IFNyBP представлены на рис, 19, В редуцирующих условиях электрофоретическая подвижность рекомбинантных белков соответствует полипептидам с молекулярными массами около 35 кДа (рис, 19А, дорожки 3, 4), а в нередуцирующих - около 65 кДа (рис. 19А, дорожки 1,2; рис. 19Б, дорожка 2), что соответствует мономерным и димерным формам IFNy-связывающих белков, соответственно. Несовпадение наблюдаемой молекулярной массы, определенной электрофоретически в присутствии 2-меркаптоэтанола, с теоретически ожидаемой, которая должна составлять 30.5 кДа, позволяет предположить модификацию данных белков гликозилированием. Результаты вестерп-блот-анализа свидетельствуют, что VARV-IFNyBP и MPXV-IFNyBP секретируются в культуральную среду клеток насекомых и аффинно выделяются в виде ковал ентно-связаиных димеров (рис. 19). Полученные результаты согласуются с опубликованными ранее данными для IFNyBP VACV (Alcami and Smith, 2002.), который также образует гомодимеры с молекулярной массой около 68 кДа. В этом заключается существенное отличие вирусных интерферон-связывагощих белков от клеточных аналогов, димеризация которых происходит только в присутствии лиганда (Goodbourn et al, 2000). Димерная форма IFNy-связывающих вирусных белков, возможно, увеличивает их способность связывать и ингибировать действие IFNy по сравнению с клеточными рецепторами. к 5.7. Изучение биологической активности VARV-IFNyBP и MPXV-IFNyBP in vitro Для того чтобы показать способность полученных рекомбинантных вирусных белков предотвращать взаимодействие hlFNy с соответствующими рецепторами эукариотичсских клеток, исследовали их способность ингибпровать защитное действие hlFNy при заражении ВЭМКМ культуры клеток L68. Результаты проведенного анализа, представленные на рис. 20, свидетельствуют, что вирусные белки нейтрализуют активность hlFNy дозозависимым образом, причем 50% нейтрализация действия hlFNy (4 нг/мл) достигается при концентрациях, равных 40-70 нг/мл и 100-140 нг/мл для VARV-lFNyBP и MPXV-IFNyBP, соответственно. Для контроля специфичности обнаруженных биологических эффектов вирусных интерфсрон-связывающих белков использовали синтезированный в бакуловирусной системе и выделенный методом аффинной хроматографии VARV-CrmB.
Добавление этого белка в реакционную смесь вместо IFNy-связывающих белков пс снимало защитный эффект hlFNy. Интересно было сравнить эффективность нейтрализации hlFNy полученными нами вирусными белками и аналогичным действием коммерческих препаратов IFNyR. 50%-ный эффект нейтрализации действия IFNy человека (2 нг/мл) для IFNyR достигается при концентрациях 2-6 мкг/мл (R&D system catalog). В проведенном исследовании мы оценивали этот параметр для вирусных интерферон-связывающих белков как 0.06-0.1 мкг/мл, что предполагает большую эффективность связывания лиганда вирусными белками. Электрофоретический анализ полученных препаратов рекомбинантных СппВ и CrmB/IgGl в редуцирующих и нередуцирующих условиях представлен на рис. 21, 22. В редуцирующих условиях электрофоретическая подвижность афинноочищенных препаратов VARV-CrmB/IgGl и CPXV-CrmB/IgGl соответствует полипептидам с молекулярной массой около 90 кДа (рис. 22, дорожки 4, 8), препаратов VARV-CrmB, CPXV-CrmB (рис. 22, дорожки 2, 6; рис. 21, дорожки 1, 5) и MPXV-CrmB (рис. 21, дорожка 3) соответствует полипептидам с молекулярными массами 45-47 кДа. Несовпадение наблюдаемой электрофорети ческой подвижности с теоретически ожидаемой, которая должна составлять 41-42 кДа для СппВ, позволяет предположить модификацию данных полипептидов гликозилированием. В нередуцирующих условиях электрофоретическая подвижность VARV-CrmB/IgGl, CPXV-CrmB/IgGl и VARV-CrmB соответствует димерным формам белков (молекулярная масса около 170 кДа и 90 кДа, соответственно) (рис. 21, дорожки 4, 8, 6), тогда как препараты MPXV-CrmB (рис. 21, дорожка 4) и CPXV-CrmB (рис. 22, дорожка 1; рис. 21, дорожка 4) при используемой схеме очистки выделяются преимущественно в мономерной форме. Для проведения вестерн-блот-анализа использовали иммунную сыворотку, полученную иммунизацией кроликов очищенным белком VARV-CrmB, или коньюгат пероксидазы хрена с антителами козы против иммуноглобулинов человека. Результаты вестерн-блот-анализа полученных препаратов рекомбинантных белков показали, что электрофоретическая подвижность химерных белков составляет 170 кДа и более в нередуцирующих условиях (рис. 23, 24, дорожка 1), что свидетельствует о том, что полученные химерные белки обладают способностью к олигомеризации, в отличие от белка CPXV-CrmB, выделенному нами в основном в мономерной форме (рис. 24, дорожка 3). Создание химерных молекул с фрагментом тяжелой цепи IgG получило широкое распространение.
Данный класс белков, включающий в себя цитокины, рецепторы цитокинов, комплементсвязывающие белки, ферменты, молекулы адгезии, насчитывает более 50 членов, представляющих собой ковалентно-связанные димеры, напоминающие молекулы иммуноглобулинов. Такие молекулы отличаются от своих прототипных аналогов значительным увеличением авидности и времени полужизни (Chamow and Ashkenazi, 1996). Как правило, химерные белки, содержащие IgG-фрагмент, представляют собой дисульфидно-связанные гомодимеры, которые напоминают молекулу IgG, но не содержат СН1-домен и легкую цепь. Для получения химерных СгтВ, мы выбрали фрагмент тяжелой цепи иммуноглобулина человека, включающий в себя шарнирный район, СН2- и СНЗ-домены (рис. 25). Сохранение шарнирного района тяжелой цепи IgG при конструировании химерного белка способствует правильной укладке доменов и помогает сохранить функции обеих частей молекулы (Chamow and Ashkenazi, 1996). Таким образом, как и предполагалось, добавление фрагмента тяжелой цепи IgGl человека к белкам СппВ привело к олигомеризации последних. Также для проведения вестерн-блот-аиализа использовали антитела к химерному белку глютатионтрансфераза/VARV-CrmB (AbGSTWARv-сппв) и антитела к очищенному белку VARV-CrmB (AbvARV-crmiO- Результаты этого анализа представлены па рис, 26. Было обнаружено, что интенсивность люминесцентных сигналов различается, и составляет, как показано денситометри ей, в относительных единицах 1 : 0.5 : 0.2 для VARV-, CPXV- или MPXV-CrmB, соответственно (рис. 26Б). Не удивительно, что наиболее интенсивный сигнал детектировался при взаимодействии используемых антител с VARV-CrmB (рис, 26, дорожка 3); разница в интенсивности сигналов проб MPXV-CrmB и CPXV-CrmB (рис. 26, дорожки 1 и 2, соответственно), по-видимому, отражает большую аффинность CPXV-CrmB к антителам AbGST/VARV-сплв и AbvARV-crmH " сравнению с MPXV-CrmB и, соответственно, различия в антигенной структуре исследуемых белков. Для подтверждения этого предположения VARV-CrmB был проанализирован с помощью программы ADEPT на наличие линейных В-клеточных антигенных детерминант. Выравнивание аминокислотных последовательностей VARV-CrmB, CPXV-CrmB и MPXV-CrmB показало наличие аминокислотных замен в участках, соответствующих предсказанным антигенным детерминантам (процент идентичности составил 87% для VARV-CrmB и CPXV-CrmB, 78% для VARV-CrmB и MPXV-CrmB) (табл. 15). Полученные результаты позволяют предположить, что имеющиеся аминокислотные замены в области антигенных дегерминант могут обуславливать различия во взаимодействии исследуемых белков с Abcsr/vARv-cmiB и AbvARV-crmB, причем эффективность связывания этих АЬ с CrmB будет убывать в ряду VARV-CrmB CPXV-CrmB MPXV-CrmB, что соответствует полученным экспериментальным данным.
