Содержание к диссертации
Введение
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 9
1. Вирус гепатита В, его место в группе HBV-подобных вирусов (гепаднавирусов) .10
2. Структура HBV II
2.1. Вирусные антигены II
2.2. Структура геномной ДНК HBV 13
3. Генноинженерный этап в изучении HBV 15
3.1. Клонирование, вирусной ДНК в бактериальных векторах 15
3.2. Первичная структура генома HBV 17
4. Экспрессия гена HBsAg в бактериальных клетках . 20
4.1. Структура HBsAg 20
4.2. Иммунологические свойства HBsAg 24
4.3. Синтез HBsAg в бактериальных клетках . 26
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 32
1. Бактерии, плазмидные и фаговые вектора 33
2. Ферменты 33
3. Электрофорез ДНК 34
4. Препаративное выделение плазмид 34
5. Отбор клонов, содержащих рекомбинантные ДНК . 36
6. Скрининг рекомбинантных плазмид 36
7. Секвенирование ДНК 37
8. Клонирование ДНК HBV 38
8.1. Выделение частиц Дейна 38
8.2. Получение ДНК HBV 38
8.3. Клонирование ДНК HBV и отбор рекомбинантных клонов 38
9. Конструирование рекомбинантных плазмид 40
9.1. Рестрикция ДНК и выделение фрагментов 40
9.2. Выравнивание "липких" концов ДНК 41
9.3. Лигирование 42
9.4. Коннекторный способ конструирования рекомбинантных плазмид ^3
10. Определение бактериальных HBsAg-полипептидов методом конкурентной иммунопреципитации 43
11. Определение молекулярной массы бактериальных HBsAg-полипептидов иммунопреципитацией белка,
меченого in vivo s-метионином 45
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 47
1. Клонирование генома HBV 48
2. Конструирование плазмид для экспрессии гена HBsAg в E.coli 51
2.1. Конструирование вектора рТК3230 56
2.2. Конструирование плазмиды рСМ8, несущей гибридный ген cat-HBsAg 60
2.3. Конструирование плазмиды рСМ217, несущей 26 63
2.4. Подстановка гибридных генов оперона E. 66
2.5. Конструирование плазмиды рКМЮ, несущей гибридный ген kan-HBsAg226 72
2.6. Подстановка гибридного гена kan-HBsAg226 под промотор триптофанового оперона
E.coli 75
2.7. Конструирование плазмиды pLH12, несущей гибридный ген Ыа-HBsAg204 75
2.8. Конструирование плазмид для прямой экспрессии гена HBsAg 78
3. Иммунологическое определение синтеза HBsAg В E.coli 80
3.1. Определение экспрессии гена HBsAg в E.coli методом конкурентной иммунопреципитации 80
3.2. Определение экспрессии гена HBsAg в E.coli иммунопреципитацией
меченого белка 87
3.3. Эффективность синтеза химерных белков, содержащих HBsAg 90
3.4. Эффективность прямой экспрессии гена HBsAg в E.coli 98
ВЫВОДЫ 107
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 109
- Вирус гепатита В, его место в группе HBV-подобных вирусов (гепаднавирусов)
- Бактерии, плазмидные и фаговые вектора
- Клонирование генома HBV
Введение к работе
Гепатит В - тяжелое инфекционное заболевание человека. Этиологическим агентом, вызывающим его, является вирус гепатита В (HBV). Опасность инфекции усугубляется тем, что, помимо острого течения заболевания, не исключена возможность его перехода в хроническую форму с тяжелыми поражениями печени вплоть до цирроза. Кроме того, имеются данные, указывающие на наличие причинно-следственной связи между вирусной инфекцией и первичным раком печени (гепатоцеллюлярной карциномой).
Распространенность этого заболевания, характеризующегося длительным периодом вирусоносительства, достаточно широка. Общее число вирусоносителей в мире достигает 170 млн. [i]. Основная роль в передаче гепатита В принадлежит различным парентеральным вмешательствам при проведении лечебно-диагностических процедур, что обусловлено спецификой распространения вируса, циркулирующего в крови больных и носителей. Помимо этого, серьезную опасность представляет также возможность вертикальной передачи вируса от матери к детям. В странах Западной Европы и Северной Америки число вирусоносителей на сегодняшний день составляет 0,1-1% населения. В СССР особенно неблагополучными в отношении гепатита В являются Казахстан, Средняя Азия и Закавказье, где число вирусоносителей колеблется от 3,8 до 6% населения [2]. Не решена проблема гепатита Вив Латвийской ССР, в которой ви-русоносительство оценивается в 1% общего числа жителей [3].
Своевременное выявление больных и вирусоносителей, а также надежный контроль медицинских препаратов на основе крови - обязательные условия для успешной борьбы с hbv инфекцией, поэтому проблема диагностики гепатита В до сих пор является крайне актуальной. Надежным средством, полностью предотвращающим возможность заболевания, является вакцинирование, что показано на примере экспериментальных вакцин, созданных во Франции и США [4,5] . Основная трудность, как при разработке диагностикумов, так и в производстве вакцины, состоит в том, что единственным источником вируса была и остается плазма крови вирусоносителеи, поскольку пермиссивная система для эффективной репликации HBV до сих пор не найдена. По этой же причине до недавнего времени не было достаточных сведений о структуре вирусного генома, а репликация вируса и в настоящее время остается практически не изученной.
Положение резко изменилось в связи с привлечением методов генетической инженерии к исследованиям круга проблем, связанных с вирусом гепатита В. Клонирование и секвенирование ДНК hbv привело к локализации^ генов известных к тому времени вирусных антигенов и, в первую очередь, гена поверхностного антигена (HBsAg) -основного белка оболочки, ответственного за антигенные свойства вирусной частицы. Это позволило надеяться на создание массового источника HBsAg в результате высокоэффективной экспрессии гена HBsAg в гетерологичных системах - бактериях и дрожжах. В это время успешно решались проблемы экспрессии клонированных эукари-отных генов в клетках прокариотов, в результате чего были созданы предпосылки для бактериального производства таких белков как инсулин, интерферон, гормон роста человека [б-9]. Однако, при экспрессии оболочечных генов вирусов в бактериях возникли существенные затруднения, связанные, вероятнее всего, со структурной организацией этих белков, отличающихся гидрофобностью и об- - 8 -разующих сложные мультимерные комплексы. Специальные приемы позволили, тем не менее, добиться высоких выходов белка оболочки вируса ящура [10 J и гемагглютинина гриппа [ill. Очевидно, синтез подобных белков токсичен для Escherichia coli, что и стало причиной относительных неудач при экспрессии гена HBsAg в бактериальных клетках.
Целью настоящей работы является подробное и систематическое исследование возможностей экспрессии гена HBsAg в бактериях. Для этого предпринято клонирование генома HBV с локализацией гена HBsAg и конструирование целого ряда плазмид для экспрессии последнего в E.coli. Экспрессия гена HBsAg осуществлялась, во-первых, путем создания гибридных генов: а) с полным геном HBsAg, но с различными по длине N-концевыми бактериальными участками ; б) с неполным, лишенным гидрофобной N-концевой части геном HBsAg, также с N-концевыми бактериальными участками различной длины. Во-вторых, сконструирована серия плазмид, отличающихся структурой участка инициации трансляции, для прямой экспрессии гена HBsAg. Выбор оптимальной конструкции как для прямой экспрессии гена, так и среди гибридных генов, помещенных под контроль различных по силе промоторов, производился с помощью специально разработанного радиоиммунологического метода, позволяющего количественно оценить синтез HBsAg-полипептидов бактериальной клеткой. Полученные результаты указывают на принципиальную осуществимость бактериального синтеза иммунологически активных вариантов HBsAg, которые могут быть использованы как в теоретическом плане - для изучения антигенной структуры белка, так и в прикладном - для иммунодиагностических целей и, возможно, для создания противогепатитной вакцины нового типа.
Вирус гепатита В, его место в группе HBV-подобных вирусов (гепаднавирусов)
Несмотря на то, что предположение об инфекционной природе гепатита В было высказано С.П.Боткиным еще в 1888 г, возбудитель заболевания, вирус гепатита В (HBV), был открыт лишь в 1970 г [12]. Это сферические частицы диаметром 42 нм, получившие название частиц Дейна по фамилии описавшего их автора. Вирус гепатита В был первым из семейства ДНК-содержащих вирусов, получившего впоследствии наименование гепаднавирусов [і]. В настоящее время к этой группе относят также вирус гепатита сусликов (GSHV) [13-15], вирус гепатита сурков (WHV) -[16,17] и вирус гепатита В уток (DHBV) [їв]. Вирусы млекопитающих - HBV, GSHV, WHV - не только обладают структурным сходством (это сферические частицы от 42 до 47 нм), но и проявляют перекрестную иммунологическую реактивность, обусловленную сходством их поверхностных антигенов [15, 17]. Для гепаднавирусов характерны такие общие черты - как ограниченный круг хозяев и отсутствие надежных систем для репликации in vitro. HBV, например, помимо человека, заражает исключительно высших обезьян, а поиски пермис-сивной системы для его репликации заканчивались, как правило, неудачей. Правда, в самое последнее время появилось сообщение о том, что в культуре лимфобластоидных клеток человека возможна репродукция HBV [19]. Репликация гепаднавирусов малоизучена. О предполагаемом механизме этого процесса можно судить лишь на основании данных, полученных для DHBV [20,2l]. Вполне вероятно, что при репликации DHBV образуется плюс-цепь вирусной РНК полной длины, т.н. прегеномная РНК, которая служит матрицей для синтеза минус-цепи ДНК (длинной цепи вирионной ДНК). После завершения минус-цепи ДНК на ней начинается синтез плюс-цепи (короткой цепи вирионной ДНК). Таким образом, при репликации DHBV имеет место обратная транскрипция, сближающая гепаднави-русы с онкорнавирусами и предполагающая наличие обратной транс-криптазы у этой группы. Интересно, что обнаружена некоторая структурная гомология между полипептидом Р (гипотетической по-лимеразой HBV) и обратными транскриптазами вируса лейкемии мышей Молони (M-MuLV) и вируса саркомы Рауса (RSV) [22]. В целом, имеющиеся в настоящее время сведения о природе гепаднави-русов, в первую очередь, HBV, явно недостаточны и требуют новых исследований, тем более, что накапливаются данные о существовании связи между HBV и такими заболеваниями как s-гепатит [і], саркома Капози [23] и даже приобретенный иммунодефицитный синдром (AIDS) [24].
Бактерии, плазмидные и фаговые вектора
Для выделения плазмидных ДНК, в том числе ДНК рекомбинант ных плазмид, осветленные лизаты клеток получали по методу Гэр-ри [iOTJ. Клетки выращивали віл питательного бульона до оптической плотности OUQ Q 0,5, после чего добавляли хлорамфе-никол до 150 мкг/мл и продолжали аэрацию в течение 20 ч при 37 для амплификации плазмидной ДНК [l08]. Клетки осаждали центрифугированием (5000 об/мин, 20 мин), суспендировали в 15 мл раствора 25G/5T, содержащего 0,05 М Трис-HGI, рН 8,0, 25%-ную сахарозу, выдерживали 5 мин, добавляли 3 мл раствора лизоцима в воде (10 мг/мл) и инкубировали 20 мин, после чего добавляли б мл 0,25 М EDTA, рН 8,0, инкубировали 10 мин, прибавляли 3 мл 10%-ного ДСН, 6,5 мл 5 М NaCl и оставляли на 12 ч для осаждения хромосомной ДНК. Все операции, начиная с момента добавления раствора 25С/5Т, проводили в ледяной бане.Хромосомную ДНК удаляли центрифугированием (14000 об/мин, 60 мин). К супернанту добавляли 2 объема охлажденного этанола и через 10 мин центрифугировали (10000 об/мин, 20 мин). Полученный осадок использовали для выделения плазмидной ДНК хроматографией на оксиапатите [109].
Клонирование генома HBV
В отличие от большинства аналогичных работ, в которых вирусные частицы выделяли из плазмы крови индивидуальных носителей с высоким титром HBsAg, мы для этой цели использовали суммарную плазму донорской крови, положительной на HBsAg и эндогенную ДНК-полимеразную активность. Препарат HBV был получен и охарактеризован сотрудниками Института микробиологии им. А.Кирхенштейна АН ЛатвССР А.П.Гринбергом и М.Б.Ривкиной в лаборатории академика АН ЛатвССР Р.А.Кукайн. Вирусную ДНК, выделенную после застройки одноцепочечного участка эндогенной ДНК-полимеразой в присутствии трех немеченых дезоксирибонук-леозидтрифосфатов и #- P-dATP, анализировали в 1%-ном ага-розном геле до и после расщепления рестриктазами (рис.7). В результате было показано, что мажорным продуктом эндогенной ДНК-полимеразной реакции является кольцевая форма ДНК HBV дли ной около 3200 н.п., которая не содержит сайтов рестрикции Hindlll, Pstl и EcoRl. Картина расщепления была идентичной для двух независимо полученных препаратов ДНК HBV. Поскольку мы не обнаружили в вирусной ДНК удобных для клонирования уникальных сайтов рестрикции, ДНК HBV расщепляли рестриктазой Ватні, для которой в ней были выявлены два сайта. Полученные фрагменты ДНК длиной около 1660 и 1450 н.п. лигировали с ДНК плазмиды PBR322, предварительно линеаризованной Ватні и обработанной щелочной фосфатазой, используя для этого ДНК-ли-газу фага Т4 .
