Введение к работе
Актуальность проблемы. Рлгрус ящура является возбудителем широкораспространенного заболевания парнокопытных животных. Из 7 серо-типов вируса ящура, относящегося к семейству ликорнавирусов, для европейской территории характерны свротипы А, О и С. В настоящее время предотвращение эпидемий ящура в странах с высокоразвитым животноводством основано на проведении карантинных мероприятий, а также иммунизации сельскохозяйственных животных убитой вирусной вакциной. Однако применение такой вакцины сопряжено с опасностью культивирования вирусов, нестабильностью полученного препарата, а также возникновением вспышек заболевания вследствие неполной инактивации вирусных частиц.
Другим несомненно перспективным путем является создание вещественной вакцины. Установлено, что основные антигенные сайты, участвующие в нейтрализации вируса, тлеют конформацдонную природу; троявлэние их свойств во многом определяется целостностью вирусного капсида. Белок оболочки VP1, содержащий главные антигенные детерминанты вируса, в изолированном виде является слабым ишупоге-юм, что ограничивает его применение в качестве субъединичной вак- ' щны. Более эффективным является использование для вакцинации ко-ютких пептидов, представляющих собой поверхностные антигены виру-га. В результате изучения лабораторного штамма 0..К было определено юложешта главной антигенной детерминанты вируса, соответствующее вариабельному участку 141-160 белка VP1, а также С-концевого имму-югенного зпитопа в константной области 200-213 этого белка. Синтетические пептиды, соответствующие аминокислотным последователь-' гостям 141-160 и 200-213 белка .VP1, конъюгированные с белком-носи-'елем, при иммунизации индуцировали образование виру,снейтрвлизув-щх антител. Объединение вариабельного п константного иммупогенных
апитопов в составе одного пептидного фрагмента, имитирующего пространственную структуру основного конфирмационного сайта вируса, привело к значительному усилению иммунного ответа. Таким образом, синтетические пептида являются эффективным инструментом изучения антигенных эпитопов вируса. В то же время, при современном уровне развития пептидного синтеза промышленная наработка больших количеств пептида для практического применения в качестве вакцины вряд ли экономически целесообразна.
Использование технологии рекомбинантных ДНК для продукции им-муногенных пептидов обладает рядом преимуществ. Появляется возможность направленного воспроизводимого соединения антигенного участка с молекулой белка-носителя путем биосинтеза единой аминокислотной последовательности. Экспрессия рекомбинантных генов в бактериальной или животной клетке упрощает наработку' и выделение имму-нологически активных белков. Включение генов гибридных белков в состав генома непатогенных вирусов открывает возможность для создания "живых" вакцин против вируса ящура.
Цель работы. Целью настоящей работы явилось получение и клонирование в плазмидшх векторах фрагментов ДНК, кодирующих иммуноген-ные аіштоїш вируса ящура серотипов А22 и 0194; создаїше рекомбинантных плазмид, детерминирующих биосинтез иммуногенннх эпитопов вируса в составе гибридных белков; изучение иммунологических свойств полученных гибридных белков, і также возможности их использования в качестве вакцшш против ящура.
Научная новизна и практическая ценность работы. В результате проделанной работы химико-ферментатившм синтезом или с помощью полиморазной цепной реакции получены двухцепочечные ДНК, кодирующие основные иммуногенныэ эгштош вируса ящура серотипов А22 и 0194- На основе полученных генэквивалентов антигенных детерминант
-з-сконструирован ряд искусственных генов, кодирующих с- и н-концевые гибрида фактора некроза опухолей человека и антигенных детерминант вируса ящура штаммов Ag2 и 0194 (схематически представлены на рис.1). Получены штаммы Escherichia coll, эффективно экспрессируп-щие гибридные гены под контролем тандема ранних промоторов А2 и A3
aZ
tnf
'kl
аЗ a2 аЗ ~~o~
(b)z
аЗ аЗ аЗ
lb).
аЗ а2
02'
Рйс.1. Схема гибридных генов tn/ с генэквивалентами антигенных детерминант вируса ящура штаммов А22 и 0194 (а). Указаны наименования плазмид (б), содержащих искусственные гены, и кодируемых ими белков (в). а1, о2, аЗ - генэквивалэнтн антигенных детерминант, соответствующие участкам 131-152, 13І-160, 200-213 аминокислотной последовательности VP1 штамма А22; Ь - гензквивалент участка 130-160 VP1 0194
бактериофага Т7. Методом иммуноблоттинга показано, что гибридные белки с антигенными детерминантами специфически взаимодействуют с поликлональными сыворотками против соответствующих вирусов ящура.
Разработана методика выделения гибридных белков из бактериальной массц В.coll. Совместно с научно-исследовательским ящурішм институтом (г. Владимир) исследованы иммуногешше свойства некоторых гибридных белков с С-концевым располоікеїшем антигешшх детерминант. В опытах на бксперкмвитальних юівотшіх (морские свішки) и на овцах показано, что искусственные бе ліси инициируют образовашш вируснейтрализующих антител и обеспечивают эффективную защиту животных от вирусной инфекции. При этом в случае гибридного белка Рб, содержащего аитигешше детерминанта серотипов &22 и 0194, экспериментальные животные были защищены от инфекции вирусами обоих еоротшов. Полученные результаты свидетельствуют о возможности практического использования гибридішх белков в качестве вакцины против вируса ящура.
Апробация работы. Материалы диссертации били доложены на международной конференции но Оиотехнолопш (Куба, 1983 г.), на конкурсе молодых ученых ШЗХ РАН (1Э8Э г.), на V конференции Российской Федерации "Новые направления биотехнологии" (Пушино, 1992 г.).