Введение к работе
Актуальность пробдеш. МеТИЛОТрофше ДрОККЯ РОДОВ Hansenula И
Pichia, наряду с дрожхаш-сахаромицетами, стаж в последнее время одним из наиболее перспективных объектов, биотехнологии и генетической инженерии. Разработка систем молекулярного клонирования и экспрессии генов для этих микроорганизмов позволили создать штаммы н. polymorphs и P.pastor is - продуценты поверхностного антигена вируса гепатита В человека, сывороточного
альбумина, ГЛЮКОаМИЛаЗЫ ИЗ Schvanniomyces occidental із и многих
других рекомбинантных биологически активных голипептидов
(Janowicz Z.A., 19В8, Csllissen G. , 1990, M.A.Hodgklns at al. ,
1990]. Преимущества метилотрсфянх дрозаеї как продуцентов чужеродных Оелкоз определяются рядом обстоятельств, в том числе простотой культивирования рекомбинантных зтадаоз на дешевих питательных средах, большим выходом биомассы и высоким уровнем экспрессии гетврслогичных генов, обеспечиваемым сильными регулируемыми промоторами генов утилизации метанола :.'.етанол-оксидаза, фэряштдегидрогеяаза и другие). Существенным ~"яется таазе тег факт, что метклотрейзне дреэзхи: способны "^активно езкоетирсвать гетерологичные Іедки и правильно
ІТДЄШІіїТЬ ?-1'КерОДНЫ9 СИГНаЛЬННе пеПТИДН [ Z.A., 1950!.
Отг.:счекнне особенности меиистрофных дрогагей зрэдоставля:-?? прзкраснуд зозтсдаость создания, на их основе, нсвых татшлов-хгесдуцокто'? "Pic-tx практически зяясннх белков, как гор:'огы, -.оируеккэ злтигсш; л т.д., а таксе исследования саксзсморяссгеії как биосинтеза, так и секрєцуш гзтерологичннх белков. Цель и лзіа^и исследования заключались в создании универсальных кассет экспрессия гетерологичшх генов з метЕлотрофных дрожах
рода Hansenula polymorphs., ЇІОДборЗ ЕЙйеКТКВВСЙ СИСТЄШ
вектор-хозяин, исследовании закономерностей биосинтеза и секреции гормона роста челозєїса (СТГ), а таккз закономерности биосинтеза основного її среднего поверхностных бэлкез {ОПБ и СПБ) вируса гепатита 3 человека. Для этого необходимо:
- клонировать ген гормона роста человека под контроль промоторной
и терминаторной ооластеи гена МОХ и сигнальной последовательности
СекреЦИИ Гена UFal, ПОЛОВОГО фероМОНа ДрОХХеЙ S.cerevisiae и на ЄЄ 0CH0B8 ПОЛУЧИТЬ ВеКТОр ДЛЯ Трансформации ДрОЖКеЙ Н.polymorphs;
- клонировать генн ОПБ и СЛБ вируса иву под контроль промоторной
и терминаторной областей гена МОХ и на их основе получить
автономно, реплипируидаеся и интегративныё- -вектора для
Трансформации ДрОМЮЙ H.polynorpha;
получить стаОяяьвне трансформанга, продуцнрувдге гормон роста человека и поверхностные антигены вируса hbv;
изучить с помощью яолученнах плазмвд закономерности экспрессии гетерологичных генов в метипотрофннх. дрожках рода H.polymorpha.
Научная новизна и практическая значимость. На основе клонированных регуляторних последовательностей гена МОЇ создана универсальная векторная молекула для клонирования и экспрессии ГетерОЛОГШНЫХ ГЄН03 В М8ТИЛ0ТрОфНЫХ дрокхах рода H.polynorpha.
Получен рекомОинантный штамм н.polymorphs эффективно секретирувдий СТГ под контролем МОХ промотора и сигнальной последовательности гена UFoi s.cerevisiae. Показано,- что использование препропоследовательносгь гена «F обеспечивает секрецию более 90Ж экспрессируемого белка. Получены
реКОМбИНаНТНЫе ШТаЫШ H.polymorpha ЭКСПреССИруЮЩИе S И preS2-S
антигены вируса гепатита В. Показано, что использование фрагмента митохондриальюй ДНК c.utilis способствует процессу интеграции плазмидной ДНК, но не обеспечивает ее мультимеризацию, как было
ОТМеЧеНО В (ИКОНОЖШа Р.Н. , 1987). В Штамме H.polymorpha Ш.1
показано наличие, по крайней мере пяти хромосом, а такке хромосомная локализация генов мох, das и his3.
Результаты работы могут служить основой для создания промышленных штаммов эффективно экспрессируюцих и секретирущих целый ряд важных для медицины белков, а также детального изучения структуры и организации генома метилотрофных дрожжей '.рода
H.polymorpha..
Апробация работы- материалы диссертации были представленны на Всесоюзных конференциях "Новые направления биотехнологии", Пущино, 1990, на IV Школе-семинаре "Перспективные направления молекулярной биология", Юрмала,- 1990, на Международном симпозиуме
Golden Jubilee Symposium, India, 1991, на НаУЧНОМ КОЛЛОКВИУМЄ
Инженерного центра "Биоинженерия", Москва, 1991.
Структура и. объем диссертации. Диссертация состоит из введения и
трех глав: обзор литературы, материалы и метода, результаты и
обсуждение. Она изложена на страницах, содержит рисунков
и библиографический список из названий.