Введение к работе
Актуальность работы. Почти 20 лат успешно используются а фундаментальных исследованиях и для медицинской диагностики конок лональные антитела. Однако, при использовашзі нативідіх мышиных моноклональных антител для in vivo диагностдаи и терапии онкологических заболевании возникает иммуішей ответ у гшцшнта при введении этих реагентов. Современный анализ использования одноцепочечных антител для обнаружения раковых образований показал значительные преимущества их использования в клинике по сравнению с интактными антителами и Fab-фрагментами. Эти преимущества состоят в следушем: а) небольшой период жизни Fv-фрагментоэ, вводимых в организм, что особенно важно, когда к ним присоединены изотопы или токсические агенты; б) одноцепочечныэ Pv не аккумулируются в почках, как это происходит с Fab-фрагментами; в) маленький размер одноцепочечных Pv облегчает их проникновение к раковым клеткам или другим мишеням; г) они имеют значительно меньшую иммуногенность, т.к. не содержат константных доменов иммуноглобулинов; д) могут быть получены в значительных количествах в бактериях и, следовательно, не могут быть загрязнены эукариотическими вирусами; е) собственный малый размер таких антител позволяет присоединять к ним различные другие агенты (токсины , изотопы, ферменты, связывающие участки различных лекарственых молекул и т.д.).
В качестве объектов для работы были выбраны антитела к ферритину из селезенки человека и к белку р24 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1). По опубликованным данным, меченные изотопами антитела к ферритину были с высокой эффективностью использованы для лечения карциномы печени, не подданцейся хирургическому вмешательству, а также при болезни Ходжкияа (Hoefnagel, 1991). многие злокачественные клетки человека экспонируют на своей поверхности ферритин. В настоящее время меченные иаотопами антитела к ферритину человека находят очень широкое применение в диагностике и терапии онкологических заболеваний (Langmuir, 1992), никоим образом не уступая в этом антителам к другому маркеру злокачественных образований - раково-эмбриональному антигену. Белок р24 ВИЧ-1 выявляется в крови зараженных лиц за 2-9 недель до появления антител к вирусу (Goudsmit et al., 1988). Переход инфекции в активную форму характеризуется антигенемией по белку р24 и может служить
прогностическим признаком (Rosenberg et al., 1989). Антитела, специфически узнающие определенные эпитопы вирусных белков, являются тонким, инструментом для изучения их структуры и функций, и могут оказать существенную помощь В раэработкэ противовирусной вакцины.
Настоящая работа посвящена экспрессии в клетках E.colt гена, кодирующего одноцепочечные антитела к ферритину человека, могущих кайти широкое применение в терапии к диагностике онкологических заболеваний человека.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в получении и исследовании экспрессии гена, кодирующего одноцепочечные антитела к ферритину человека в клетках Е.ооїі. В задачи исследования входило:
-
- клонирование V-сегментов генов иммуноглобулинов из клеток гибридом мыши, секретирупцих антитела к ферритину человека и к белку р34 ВИЧ-і
-
- клонирование последовательности, кодирующей, сигнальный пептид пектатлиазы В E.carotovora, который используется для направления секреции рекомбинантннх антител в периплазматическоэ пространство бактериальных клеток
-
- создание конструкции для экспрессии в клетках E.coli гена одпоцепочечных антител к ферритину человека
-
- экспрессия гена, кодирующего одноцепочечные антитела к ферритину человека, в клетках Е.ооїі
-
- получение и исследование связывапдих ' характеристик рекомбинантннх антител к ферритину человека
Научная новизна и практическая ценность. Клонированы и определена структура четырех новых экспрессируемых иммуноглобулиновых генов мыши. Разработан способ ориентированного объединения фрагментов ДНК о помощью полимеразной цепной реакции (ПНР) для сборки конструкции, кодирующей одноцепочечные антитела. Сконструирован ген одноцепочечных антител к ферритину человека. Осуществлена экспрессия этой конструкции в клетках E.coLi BL2HDE3) (Studler et al., )987). Клонирована и исшльзоване для экспрессии гена одноцепочечных антител последовательность, кодирующая лидерный пептид пектатлиаэы В ' E.carotovora. Лидерный пептид направляет экспресеируемые белки в периплазматическое пространство бактериальных клеток, что способствует правильной укладке экспрессируекой полипэптидпой цени. Изучено влияние
условий выращивания экспрессиругацих клеток на выгод функционально активных рекомбинантных антител. Очищены и изучены иммунохимические характеристики одноцепочечных антител к ферритину человека.
Аппробация работы.
Представленные в диссертации результаты были доложены и обсуждены на международном симпозиуме "Каталитические антитела и инженерия антител" (Москва, 1993), на 12-м европейском конгрессе по иммунологии (Барселона, 1994) и на заседаниях коллоквиума лаборатории молекулярно-генетической иммунологии ИМВ РАН.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов, списка литературы. Материал изложен на 121 странице машинописного текста, включает 23 рисунка и библиографический список из 133 названий.