Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы б
I. Повторяющиеся элементы ДНК. б
1.1. Типы ДНК-повторов-тандемные (сателлитные) и диспергированные. 6
1.2. Диспергированные повторы - классификация и структура. б
1.3.1. Длинные ретропозоны (LINEs). 7
1.3.2. Короткие ретропозоны (SINEs): общая характеристика. 9
1.4. Размножение и эволюция SINE. 12
1.5. Функции SINEs и других повторов. 13
1.6. Многообразие типов коротких ретропозонов в геномах животных . 14
1.7. SINE в геноме чешуйчатых рептилий. 18
1.8. Способы поиска новых семейств SINE в геномах. 19
II. Проблемы молекулярной таксономии и систематики чешуйчатых рептилий (отр. Squamata) 21
2.1. Внутриотрядная систематика рептилий отр. Squamata. 21
2.2. Проблема систематики на низших таксономических уровнях ящериц семейства Lacertidae 21
2.2.1. История изучения кавказских скальных ящериц. 22
2.2.2. История изучения лесных видов (D. derjugini и D. praticola). 26
2.2.3. История изучения зеленых ящериц (род Lacerta s.str.). 28
Глава 2. Материалы и методы 30
2.1. Материалы, реактивы и приборы, использованные в работе. 30
2.1.1. Ферменты 30
2.1.2. Плазмидные векторы 30
2.1.3. Другие реактивы 30
2.1.4. Материалы 30
2.1.5. Приборы 30
2.2. Выделение ДНК. 31
2.3. Поиск и выделение копий SINE в геномах исследуемых видов. 32
2.3.1. ПЦР. 32
2.3.2. Клонирование ПЦР-продуктов. 33
2.3.3. Создание геномных клонотек и их скрининг. 33
2.3.4. Выделение плазмидной ДНК. 33
2.3.5. Дот-гибридизация ДНК. 34
2.3.6. Секвенирование ДНК. 35
2.4. Компьютерная обработка нуклсотидных последовательностей SINE 35
2.5. Inter-MIR-ПЦР. 35
2.6. Анализ паттернов Inter-MIR-ПЦР и построение дсндрограмм. 36
2.7. Компьютерная обработка последовательностей мономеров сателлитной ДНК ящериц . 36
Глава 3. Результаты 37
3.1. Характеристика повтора Squam-1: структурные особенности. 37
3.2. Таксономическое распространение Squam-1. 45
3.3 Характеристика повтора Squam-2: структурные особенности . 51
3.4. Таксономическое распространение Squam-2. 53
3.5. Inter-MIR-ПЦР и анализ мономеров сателлитной ДНК. 57
Глава 4. Обсуждение 66
4.1. Squam-І и Squam-2 - новые семейства коротких рстропозонов в отряде чешуйчатых рептилий (Squamata): их свойства и сопоставление. 66
4.2. Использование Inter-SINE-ПЦР и сателлитной ДНК при изучении эволюции и таксономической структуры рептилий. 75
Выводы 30
Благодарности 81
Список литературы 82
- Многообразие типов коротких ретропозонов в геномах животных
- Проблема систематики на низших таксономических уровнях ящериц семейства Lacertidae
- Компьютерная обработка последовательностей мономеров сателлитной ДНК ящериц
- Характеристика повтора Squam-2: структурные особенности
Введение к работе
Повторяющиеся некодирующие последовательности ДНК приобретают все большее значение по мере накопления данных об их влиянии на функционирование и эволюцию генома. В последние годы опубликованы многочисленные сообщения о прямом влиянии повторов на структуру и экспрессию генов, которое не может не сказываться на эволюционной истории организма. Кроме того, тапдемные (сателлитные) и диспергированные повторы служат важным источником знаний об эволюционной истории таксона и во многих случаях являются более надежным типом молекулярных маркеров, чемЬ ядерные или митохондриальные гены. Во многих группах эукариот применение методов, прямо или косвенно основанных на свойствах повторов, позволяет исследовать филогенетические отношения и реконструировать картину эволюционной истории групп.
Диспергированные повторы типа SINE (Short INterspersed Elements), называемые также короткими ретропозонами, составляют значительную долю генома многих позвоночных животных. Эти последовательности наиболее изучены у млекопитающих и рыб, на примере которых были установлены некоторые общие свойства SINE и их типы (Kramerov and Vassetzkv, 2005). Однажды возникнув и распространившись в геноме, SINEs сохраняются в течение десятков и даже сотен миллионов лет, претерпевая случайные мутации, и их нуклеотидные последовательности постепенно вырождаются. Наличие в геномах изучаемых таксонов определенного семейства SINE, или же отдельных их копий в гомологичных локусах, являются признаком их родства. SINE были охарактеризованы и использованы для изучения эволюции в ряде таксонов животных и растений. Однако до последнего времени повторы этого типа не были известны у чешуйчатых рептилий (ящериц и змей, отр. Squamata). Эта группа рептилий чрезвычайно обширна, а ее таксономия сложна и во многом противоречива. В то же время, разработка эволюционных маркеров на основе специфических коротких ретропозонов могла бы пролить свет на проблему филогении рептилий. Это, в свою очередь, необходима для разработки молекулярно-генетических основ систематики данной группы позвоночных и для понимания путей молекулярной эволюции одной из важных частей геномной ДНК.
Кроме использования повторов типа SINE как таковых для изучения филогении наЬ уровне семейств и отрядов, в нашей работе для изучения эволюции на уровне подвидов, видов и родов, применяли метод Inter-SINE-ПЦР, характеризующий спейсерные участки ДНК между копиями SINE, рассеянными по геному (Buntjer, 1997). Сравнение полиморфизма длин этих фрагментов по картине их электрофоретического фракционирования позволяет оценить степень родства изучаемых таксонов.
Помимо описанных выше методов, для изучения молекулярной эволюции рептилий ВІ-нашей лаборатории был успешно применен сравнительный анализ родоспецифичных сателлитных повторов на низшем таксономическом уровне. Результаты использования Inter-SINE-ПЦР и анализа последовательностей сателлитной ДНК для реконструкции филогении сложных в таксономическом отношении групп рептилий автором данной диссертации может существенно дополнить результаты, получаемые с помощью других методов изучения эволюционной истории таксонов, и помочь прояснить вопросы их молекулярной эволюции и систематики.
Таким образом, результаты данной работы, затрагивающие проблему молекулярной филогении рептилий в диапазоне от видового уровня до уровня родства внутри класса, связаны с решением одной из наиболее актуальных проблем современной молекулярной эволюции.
Цели и задачи работы
Целью работы были поиски, выделение и изучение специфических коротких ретропозонов типа SINE в геномах чешуйчатых рептилий (отр. Squamata), а также характеристика участков ДНК, фланкированных копиями SINE. Кроме того, целью работы было использование диспергированных и сателлитных повторов ДНК для изучения эволюции рептилий.
Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи.
Обнаружить и охарактеризовать повторы типа SINE в геномах рептилий отряда Squamata. Исследовать молекулярную эволюцию этих повторов с использованием возможно'»-большего числа таксонов рептилий.
Использовать сравнительный анализ последовательностей и свойств повторов типа SINE для изучения филогении на уровне отряд-семейство-род.
Применить метод Inter-SINE-ПІДР для изучения генетического родства низших групп организмов на уровне популяция-подвид-вид (на примере прыткой ящерицы Lacerta agilis, а также Кавказских скальных ящериц рода Darevskia (сем. Lacertidae)).
4. Сопоставить результаты использования разных молекулярных методов для построения обоснованной на молекулярном уровне таксономии изучаемых рептилий.
Многообразие типов коротких ретропозонов в геномах животных
Считается, что размножение SINE происходит согласно так называемой "master gene"-теории (DEININGER and BATZER, І 995). Активно размножающийся SINE представлен в геноме одной или несколькими мастер-копиями (master genes), с которых транскрибируется соответствующая РНК, встраивающаяся затем в геном. Механизм встраивания, видимо, определяется действием LINE-эндонуклеазы, которая не проявляет, в большинстве случаев, сайт-специфичности. Нередко SINE находят в А-богатых областях генома, в том числе, в поли(А)-хвостовых участках SINE млекопитающих (JURKA and KLONOWSKI, 1996). В геноме собаки Canis familiaris обнаружены семейства тРНК-родственных SINEs, которые часто оказываются встроенными в LINEs, а также в сателлитную ДНК (BENTOLILA et al., 1999). Подавляющее большинство новых копий SINE не попадает в благоприятное для экспрессии генетическое окружение и перестает размножаться. С течением времени эти копии накапливают случайные мутации. Те же из них, которые получают возможность транскрибироваться на новом месте и, таким образом, порождать новые копии, могут становиться родоначальниками новых линий или даже семейств SINE. При инактивации мастер-генов SINE перестает размножаться. Вероятно, прекращение ретропозиционной активности для многих семейств SINE сопряжено с прекращением функционирования LINE-партнера и прекращением синтеза необходимой для размножения обратной транскриптазы (RJNEHART et al., 2005). Возможно, замена З -хвоста SINE на соответствующий участок другого, активно размножающегося, семейства LINE из генома того же вида позволяет емуі продолжить размножаться в виде нового семейства или подсемейства, как это может быть в случае, когда в геноме одного вида разные семейства SINE отличаются только по своим V-частям (KIDO et al., 1994; OGIWARA et al., 2002). После прекращения ретропозиционной активности мастер-генов все копии данного семейства продолжают случайным образом мутировать, и определить последовательность исходной master-копии можно лишь косвенно, по консенсусу всех известных копий этого семейства. При отсутствии механизма специфической .элиминации (вырезания) сохраняется положение в геноме копий SINE в течение значительного времени, что делает их удобными маркерами при реконструкции филогенетических процессов (HILLIS 1999; BASHIR et al.; 2005; SHEDLOCK and OKADA, 2000).
Несмотря на то, что до настоящего времени нет полной ясности в вопросе о функции "избыточной" ДНК, состоящей, в основном, из повторяющихся элементов, появляется все больше убедительных данных в пользу функциональной значимости такой ДНК. Например, диспергированные повторы участвуют в регуляции активности генов, в образовании "горячих точек" рекомбинаций, а также вовлечены в качестве готовых к использованию функциональных блоков для синтетических процессов (MAKALOWSKI et al., 1994; LORENC andb MAKALOWSKI, 2003; WEINER, 2002; KRAMEROV and VASSETZKY, 2005). Распространенное до недавнего прошлого мнение о паразитической природе некодирующих повторов подвергается критике сразу с нескольких позиций (ZUCKERKANDL, 1992). Во-первых, трудно представить, чтобы организм, в геноме которого произошло размножение функционально нейтрального (или тем более вредного) элемента, смог выжить и получить возможность оставить потомство, закрепив таким образом данный апоморфный признак. Во-вторых, поддержание существования таких массивных структур, как сателлитная ДНК или множественные копии рассеянных по геному повторов псевдогенов, требует больших затрат, что также должно делать их "содержание" невыгодным и наверняка привело бы к выработке организмом защитных приспособлений для "очистки" генома от столь объемных нефункционирующих участков. Можно предположить, что вначале удалявшиеся из генома, как ненужные или вредные, элементы, могли случайным образом оказываться задействованными в жизнедеятельности генома и влиять, например, на регуляцию какого-либо этапа жизнедеятельности, что было выгодно для организма. При накоплении в достаточно больших количествах, видимо, эти элементы приобрели также иное качество -защитное. Так как элиминация или повреждение такого рода элементов намного менее критичны для организма, чем потеря функции экспрессируемых генов в результате мутации, то предположение о приобретении ими защитной, "альтруистической" роли становится не беспочвенным (ПАТРУШЕВ, 2000). Такое "разбавление" генов и экранирование их от внешних воздействий за счет образования пространственных структур совместимо с выполнением ими регуляторных функций, и, возможно, все это делает их присутствие в геноме, в целом,! , выгодным для организма.
Согласно представлению о первичности РНК как носителя генетической информации в ходе возникновения и эволюции жизни на ранних ее этапах, процесс перехода от РНК к ДНК должен отражать масштабы и важность процесса обратной транскрипции (BROSIUS 1999а, б). Этот древний механизм, по-видимому, и в настоящее время не утратил своего значения. Появляется все больше сообщений о функционирующих генах, не содержащих U интронов, и прошедших, видимо, в своей эволюции стадию РНК (BROSIUS 19996, в). Кроме того, именно тРНК, наряду с мРНК, могли бы быть не только вспомогательными молекулами при репликации РНК геномов, но и содержать значительную часть генетической информации (возможно, кодировать некоторые универсальные блоки белковых молекул). Элементы их структуры могли бы быть сравнительно легко вовлечены в процессы рекомбинации (в частности, из-за наличия внутреннего контрольного региона, позволяющего автономно транскрибироваться, и из-за небольшого размера молекул), что давало бы возможность первым геномам приобретать пластичность без значительного количества вредных мутаций (в результате, например, точечных замен в кодирующих регионах генов). Кроме того, о пользе тРНК-подобных элементов, которые могут выполнять также не только свою основную функцию, свидетельствуют данные, например, о вовлечении і . lOSa РНК (5 - и З -концы которой могут сворачиваться в тРНК-подобную структуру) в процесс коррекции биосинтеза белка на матрицах, лишенных стоп-сигнала, путем добавления аланинового остатка к С-концу новосинтезируемого полипептида и последующей смены субстрата рибосомы на саму молекулу lOSa РНК. Это позволяет не только высвободить трансляционный комплекс, но и пометить дефектный продукт (KEILER et al., 1996; OP DE BEKKE et al., 1998). Таким образом, используемая организмом в течение длительного эволюционного времени мобильность и многофункциональность генов тРНК могли создать предпосылки к образованию на их основе множества химерных мобильных элементов, которыми, в большинстве своем, и являются короткие ретропозоны (SDSfEs). Однако не только тРНК, но и многие другие малые ядерные и цитоплазматические РНК, а также гены рРНК могут образовывать мобильные ретроэлементы, однако в большинстве случаев их число невелико, а значение для генома неясно (BROSIUS, 1999B).
Проблема систематики на низших таксономических уровнях ящериц семейства Lacertidae
Систематика чешуйчатых рептилий (отр. Squamata) сложна и противоречива. В течение долгого времени единственным критерием для реконструкции филогении семейств и отрядов рептилий был набор морфологических данных. При этом однозначный выбор критериев при построении системы был практически невозможен ввиду большого многообразия признаков и таксонов, что приводило к многочисленным противоречиям в-, систематике рептилий высокого таксономического уровня. Наиболее общепринятой морфологической системой отряда Squamata, включающего ящериц, змей и амфисбен, в настоящий момент является схема, предложенная в работе Эстеса и соавт. (ESTES et al., 1988), которая является отправной точкой для данной работы. Однако появляющиеся в последнее десятилетие работы по молекулярной систематике рептилий ставят под вопрос многие положения этой классической системы (VIDAL and HEDGES, 2005).
Подобная неоднозначность существовала также в системе некоторых млекопитающих (в частности, грызунов), и только использование комплекса молекулярных маркеров эволюции этих животных позволило в значительной степени прояснить проблему (KRAMEROV and VASSETZKY, 2005). Одним из наиболее перспективных маркеров для уровіи семейств и отрядов являются специфические семейств SINE. Так как у чешуйчатых рептилий специфические короткие ретропозоны не были описаны до начала нашей работы, то исследования такого рода до настоящего времени не были возможны. В настоящее время в ходе нашей работе по поиску и характеристике SINE в геномах ящериц было обнаружено два семейства, ограниченных в своем распространении данным отрядом рептилий. Поэтому, в настоящее время появилась возможность применения подходов, использованных ранее на представителях других таксонов, к решению вопросов систематики чещуйчатых рептилий.
Поскольку нами более детально изучалась генетическая дивергенция между;, популяциями нескольких видов скальных ящериц Кавказа (п/отр Sauria, сем. Lacertidae, р. Darevskid), а также представителями группы так называемых зеленых ящериц (род Lacerta s, str.), остановимся на характеристике этих таксонов. Их систематика далека от совершенства, несмотря на значительные достижения разных авторов, изучавших этот таксон на протяжении более 100 лет. Скальные ящерицы Кавказа, долгое время рассматривавшиеся как комплекс видов L. saxicola, относительно хорошо изучены с морфологической точки зрения (ДАРЕВСКИЙ, 1967). Особый интерес исследователей к этой группе ящериц определяется тем, что среди них обнаружены партеногенетически размножающиеся популяции, происхождение и природа которых долгое время были неизвестны. Помимо скальных форм, в данном комплексе видов, ранее рассматривавшемся в составе p. Lacerta, а затем получившим недавно статус отдельного рода Darevskia (ARRIBAS, 1998), имеются наземные, лесные виды (луговая ящерица D. praticola и артвинская ящерица D. derjugini), популяционная структура которых очерчена достаточно обстоятельно благодаря, в основном, работам В. Ф. Орловой, М. А. Тертышникова и В. Бишофа (W. Bischoff). Среди них выделен ряд подвидов, однако имеются основания полагать, что на большом и сложном географически ареале могут существовать другие подвиды или виды-двойники, до сих пор не выявленные исследователями. Неясно также, насколько равноценны критерии при выделении подвидов в тех или иных видах и насколько обстоятельно, с точки зрения генетических различий, обосновано понятие "подвид" в применении к разным видам. Попытки приблизиться к решению этих вопросов с использованием коротких ретропозонов в ДНК изучаемых видов в качестве маркеров филогении изложены в данной работе. Поскольку история изучения указанного таксона служит примером несостоятельности подхода к систематике, основанного только на данных морфологии, посвятим следующий раздел описанию ситуации, сложившейся в таксономии этих ящериц к настоящему моменту.
Кавказские ящерицы рода Darevskia (сем. Lacertidae) - пожалуй, наиболее широко распространенные позвоночные животные Кавказа и прилегающих районов Малой Азии, представленные примерно 25 видами. Характерной особенностью данной группы является их высокая полиморфность. Большое разнообразие морфологических форм, а также зависимость внешних признаков от условий обитания ставили в тупик многих исследователей, пытавшихся разобраться в их систематике и филогении. История разработки системы кавказских лацертид дает многочисленные примеры противоречий и несогласованности во мнениях разных авторов.
Наиболее полная (на сегодняшний день) схема филогенетических отношений внутри сем. Lacertidae предложена Арнольдом на основании сопоставления большого числа морфологических, остеологических и, частично, биохимических данных у практически всех групп ящериц этого семейства (ARNOLD, 1989). Группа кавказских скальных ящерицу. изучаемая нами, была включена им в условную группу видов "archeolacertas", название для которой впервые было предложено Л. Мегели (Mehely) в 1909 г. В качестве ближайших к ним родов указаны Podarcis и Algyroides. Несколько дальше расположены представители зеленых ящериц рода Lacerta. Живородящая ящерица Zootoca vivipara занимает обособленное положение по отношению к перечисленным выше таксонам. В этой работе, как и во многих других исследованиях, посвященных изучению кавказских скальных ящериц, отмечен огромный внутривидовой полиморфизм морфологических признаков, что1 сильно осложняет задачу определения границ видов и приводит к многочисленным противоречиям в их систематике. Однако и в схеме Арнольда, наиболее полной и основательной, есть ряд моментов, требующих разъяснения или уточнения.
Первоначально все популяции кавказских скальных ящериц, включая современный род Darevskia, объединяли в группу Lacerta saxicola Eversmann 1934, придав ей видовой статус (здесь и далее история изучения скальных ящериц по монографии Даревского (ДАРЕВСКИИ, 1967)). Однако другие авторы рассматривали эти формы в составе подвида широко распространенной стенной ящерицы L. muralis на основании большого внешнего сходства. Мегели, на основании ряда краниологических и морфологических признаков предложил разделить всех "стенных" ящериц на две группы (Archaeolacerta и Neolacerta) и, обосновал необходимость восстановления L. saxicola как вида в составе Archaeolacerta. На основании большого коллекционного материала Мегели различает внутри него 6 подвидов и 3 вариетета. Позднее А. М. Никольский, пересмотрев все русские экземпляры ящериц, признал видовой статус L. saxicola, а внутривидовая систематика в его работе не претерпела значительных изменений по сравнению с работой Мегели. Несмотря на это, многие авторитетные европейские герпетологи того времени в своих работах, как и прежде, считали L. saxicola лишь формой внутри L. muralis, основываясь на анализе фрагментарных и немногочисленных выборок несовершенными методами, такими как морфометрическии анализ, изучение фолидоза (чешуйчатого покрова), некоторых остеологических (в основном краниологических) признаков и частично вариации окраски. Положение осложнялось тем, что в род Lacerta были также включены сильно отличающиеся от кавказских скальных ящериц европейские лацертиды.
Компьютерная обработка последовательностей мономеров сателлитной ДНК ящериц
Сигнал гибридизации геномной ДНК и обоих зондов наблюдали при анализе всех представителей чешуйчатых, однако в случае ДНК хамелеона, игуаны и агамы (входящих в кладу Iguania), а также змей (Boa constrictor и Elaphe dione) гибридизация была слабой. ДНК всех остальных животных, не входящих в отр. Squamata, или не гибридизовались ни с одним из зондов, или слабо гибридизовались только с зондом, специфичным для тРНК (рис. 12а).
В случае ДНК человека, мыши и лягушки (см. рис. 10 и 12а) слабый сигнал наблюдали при гибридизации с зондом, соответствующим участку сходства с тРНКА1а ссс .-. Это может быть обусловлено присутствием в геноме грызунов семейства SINE ID, также ведущего свое происхождение от аланиновой тРНК этого типа (см. Обсуждение результатов). Кроме того, сигнал с этим же зондом у травяной лягушки и человека может быть обусловлен присутствием в их геномах генов или псевдогенов аланиновой тРНК, однако отсутствие у этих видов сигнала гибридизации с тРНК-неродственным зондом свидетельствует о том, что в их ДНК повтора Squam-2 нет. Результаты гибридизации подтверждены также в опытах, в которых ДНК всех упомянутых животных анализировали с помощью ПЦР и праймеров Alal и Таі12 (рис. 13). Продукт реакции ожидаемого размера наблюдали в случае ДНК практически всех представителей отряда чешуйчатых, за исключением хамелеона. То, что у этой ящерицы не s удалось обнаружить специфичный ПЦР-продукт, соответствует тому, что дот-гибридизация ДНК данного вида также была очень слабой (рис. 13). Этот вопрос требует дальнейшего исследования, но связан, видимо, со степенью вырожденности или с низкой копийностыо SINE у этого вида. Обращает на себя внимание также тот факт, что две змеи из разных семейств отличаются по наличию повтора типа Squam-2 ящериц, что было показано обоими методами: Boa constrictor (сем. Boidae) содержит этот повтор в большем количестве, a Elaphe dione (сем. Colubridae), если и содержит, то в более вырожденном состоянии или в меньшем числе копий. При поиске последовательностей, сходных с изучаемым SINE в его специфической (тРНК-неродственной) части, в базе данных GenBank с помощью программы BLAST таких последовательностей не обнаружено. Сходство в области аланиновой тРНК имеется лишь в; случае SINE млекопитающих, также происходящих от этой тРНК, а именно - ID грызунов, Vic-І мозоленогих и Das-І броненосцев. В хронологически первой части нашей работы, до открытия нами семейств повторов SINE у чешуйчатых рептилий, мы предприняли работу, в которой молекулярно-генетическое родство в изучаемой группе рептилий характеризовали по межкопийным участкам, лежащим между копиями еще одного семейства SINE - типа MIR, широко распространенного в геномах высших эукариот (КОРОТКОЙ и соавт., 2000). При этом предполагали, что повтор такого типа имеется у рептилий, и использовали праймеры, предложенные ранее (JURKA et al., 1995), для амплификации фланкированных копиями МГЦ участков ДНК. Действительно,! было показано, что эти праймеры дают специфические наборы продуктов амплификации, что свидетельствовало о существовании повтора типа MIR в геноме чешуйчатых рептилий.
Таким образом, использованный нами метод Inter-MIR-ПЦР основан на электрофоретическом фракционировании локусов, амплифицированных с геномной ДНК с помощью ПЦР, которые фланкированы копиями диспергированного повтора типа MIR. Сравнение получаемых картин распределения этих спейсерных фрагментов позволяет оценить степень генетического родства изучаемых таксонов. Как было установлено нами (рис. 14), метод дает наборы фрагментов (паттерны), которые практически не различаются у индивидов одной популяции ящериц и полностью отличны у представителей разных родов изученных нами ящериц семейства Lacertidae (рис. 14, 15, 16). Это позволяет использовать метод Inter-MIR-ПЦР для изучения степени генетического родства между популяциями, на подвидовом и межвидовом видовом уровне в пределах рода. Эти показатели чрезвычайно важны и информативны для изучения начальных этапов видообразования и разработки молекулярно-генетических основ таксономии и классификации любых таксонов, в том числе - рептилий.
Данным методом у всех исследованных ящериц получены электрофоретические паттерны, содержащие порядка 100 индивидуальных полос, которые могут быть учтены при анализе сходства таксонов (рис. 14-16). На основании первичных данных составляли матрицы отсутствия/присутствия полос. Сравнение этих паттернов позволило построить депдрограммы, по которым можно оценить степень генетического родства изучаемых особей. , Описанный выше подход применен нами для изучения филогении ящериц родов Darevskia (скальные ящерицы) и Lacerta s. str. (зеленые ящерицы) из сем. Lacertidae. Ряд общих для всех видов рода Darevskia полос, отсутствующих у представителей ближайших родов (Podarcis, Zootoca и Lacerta) свидетельствует в пользу таксономической самостоятельности этого рода (одна из таких полос обведена в фиолетовую рамку на рис. 14), Практически все изученные данным методом виды рода Darevskia имеют специфические (аутапоморфные) признаки в паттернах, сохраняя при этом общие для остальных видов рода синапоморфии. Внутри каждого вида имеется, как правило, незначительная внутрипопуляционная гетерогенность и более выраженная — межпопуляционная, что позволяет оценивать степень межпопуляционных вариаций, в частности, при верификации отдельного подвидового статуса некоторых популяций. Низкая степень внутривидовой гегерогенности особенно показана на примере 13 особей одной популяции D. derjugini silvatica, которые практически не имеют индивидуальных полос (рис. 14, 15). Вопросы V внутривидовой изменчивости и межвидового сходства более подробно изучены на примере двух видов рода Darevskia и четырех видов рода Lacerta. Обособленное от других представителей того же рода положение по молекулярным методам двух видов, D. praticola и D, derjugini, соответствует их также отличающемуся от других видов положению, установленному на основании мофологических и экологических критериев. Внутривидовая структура каждого из них была изучена более подробно. Луговая ящерица D. praticola, по представлениям зоологов, состоит их двух подвидов - D. p. pontica (обитающая на Черноморском побережье Кавказа, а также, изолированно, на Балканском полуострове), и D. p. praticola (обитающая на северном Кавказе и, изолированно, в Закавказье). С помощью Inter-MIR-ПЦР исследованы несколько популяций из основного ареала, а также особи из изолированных популяций Юго-Восточного Азербайджана и с\ . Балкан. На рис. 17 и 18 представлены дендрограммы, подтверждащие различия между двумя принятыми в системе подвидами. В то же время, Азербайджанская популяция отличается от представителей подвида D. p. praticola с Северного Кавказа, и, возможно, находится в стадии образования отдельного подвида. Особи с Балкан значительно отличаются от всех исследованных кавказских популяций, и уровень их дивергенции сопоставим с подвидовым или даже видовым (рис. 18).
Два подвида другой ящерицы (D. derjugini), обитающие к югу от Большого Кавказского Хребта - D. d. derjugini и D. d. barani, оказались практически неотличимыми друг от друга (рис. 17). Таким образом, их подвидовой статус не подтверждается, В то же время, изолированный подвид D, d. silvatica, обитающий на северном склоне Кавказа, значительно отличается от южных форм и оправдывает отдельный подвидовой статус.
Характеристика повтора Squam-2: структурные особенности
Для решения всех этих проблем наших данных, конечно, недостаточно, однако можно полагать, что молекулярная основа эволюции всех чешуйчатых рептилий может быть разработана на основе обнаруженных нами диспергированных повторов.
Семейство диспергированных повторов Squam-2, отличающееся от Squam-1 по последовательности и организации, обладает рядом особенностей, не характерных для большинства типичных коротких ретропозонов. Так, у этих повторов отсутствуют какие-либо типичные для SINE структуры па З -конце (А-богатая последовательность или короткие тандемные повторы) и дупликации сайта встраивания (TSD) в окружающих последовательностях. Следует отметить, что TSD также не найдены у 5S рРНК-родственного SINE3 из генома Danio rerio (Kapitonov and Jurka, 2003). Некоторыми авторами отмечено, что LINEs из группы CR1 при интеграции в геном также не образуют TSD (KAPITONOV and JURKA 2003). Это объясняет причину отсутствия TSD в случае SINE3-семейства, так как этот тип повторов имеет сходный с CR1-родственным LINE З -конец и при ретропозиции, по всей видимости, использует его энзиматический аппарат. Вероятно, если размножение Squam-2 также зависит от неизвестного пока LINE, не образующего TSD, из генома чешуйчатых рептилий, то это может объяснять отсутствие TSD во фланкирующих регионах. Однако у полученных нами копий Squam-2 такая черта CR1 -родственных LINE и похожих на них в своей 3 -области SINE, как наличие тандемных 8-нуклеотидных димеров или других тандемных мотивов на самом З -конце последовательности, не установлено. Это говорит не в пользу предположения о сходстве Squam-1 и CR1-родственных LINE. Отсутствие типичных TSD отмечено также при изучении фланкирующих регионов Twin SINE из генома Culex pipiens (FESCHOTTE et al., 2001). При описании этого SINE авторы предполагают, что образуемые им при встраивании TSD могут быть слишком короткими (1-3 п.н.) и поэтому не обнаруживаются, или же что размножение этого ретропозона, в основном, происходит путем ДНК-рекомбинации, осуществляемой за счет механизма клетки-хозяина. Нельзя исключать возможности такого же объяснения механизма размножение и для Squam-2 SINE.
Повторяющиеся структуры на З -конце (поли(А)-хвост или короткие тандемные повторы) необходимы многим коротким ретропозонам для размножения, так как при ретропозиции этот участок SINE РНК узнается обратной транскриптазой (КАЛКА\УА and OKADA, 2002), поэтому их отсутствие у Squam-2 также требует объяснения. Недавно обнаружены повторы типа SINE млекопитающих, не содержащие поли(А)-«хвоста» (так называемые "tailless retroposons"), которые, по-видимому, должны использовать другие механизмы взаимодействия с обратной транскриптазой при ретропозиции, чем ретропозоны классического типа (Schmitz et al, 2004). Предполагается, что для некоторых SINEs консервативность вторичной структуры, образуемой З -концевой областью, важнее при ретропозиции, чем собственно первичная нуклеотидная последовательность, что также может объяснять отсутствие вышеупомянутых элементов структуры у Squam-2 {TERAI et al., 1998; MATHEWS et al., 1997). Поэтому нельзя исключить, что механизм ретропозиции этого семейства SINE рептилий отличается от используемого другими SINEs, что может объяснять отсутствие повторов на З -конце элемента, а также отсутствие TSD во фланкирующих, її областях (например, если при интеграции используется нуклеаза, не образующая ступенчатого разрыва). Другое предположение состоит в том, что, как и в случае большинства древних семейств SINE (например, CORE-SINE типа MIR (Jurka et al, 1995)), последовательности Squam-2 утеряли эти структуры в результате случайных мутаций в ходе длительной эволюции, что привело к сильной вырожденности З -концевой области. Некоторые сравнительно молодые семейства SINE имеют TSD во фланкирующих последовательностях лишь у половины копий; если принять во внимание предположительно большой эволюционный возраст Squam-2, то невозможность обнаружения TSD у этих повторов становится объяснимой. В отличие от Squam-1, для Squam-2 удалось установить тип тРНК-предшественника -тРНКА,а(ССС , имеющийся в геноме большинства позвоночных, которьш образована наиболее Ь консервативная 5 -часть изучаемого повтора. Помимо Squam-2, последовательность, очень сходная с этой тРНК, также обнаружена в составе 5 - концов трех семейств SINE млекопитающих — ID грызунов, vic-І мозоленогих и Das-1 броненосцев (рис. 116). Вероятно, данный тип тРНК неоднократно в эволюции давал начало таксон-специфическим семействам SINEs. Следует отметить, что тРНКА,а(ССС)-родственные SINE млекопитающих имеют сравнительно простую структуру, и тРНК-неродственные участки у них либо невелики по размеру, либо отсутствуют (Borodulina and Kramerov, 2005). Squam-2 представляет собой исключение в этом смысле, так как его тРНК-неродственная область имеет значительную длину, однако ее точная структура, в силу предполагаемой значительной дивергированности, остается пока неясной. Кроме того, все эти SINEs млекопитающих имеют А-богатый "хвост", в то время как Squam-2 такой последовательности не имеет. тРНК-неродственная часть Squam-2 не сходна ни с одним из имеющихся в базе данных GenBank геном или повторяющимся элементом. В нем нет открытых рамок считывания и не выражены какие-либо прямые или инвертированные повторы.
Фланкирующие последовательности Squam-2 не сходны по нуклеотидным последовательностям, что служит прямым свидетельством того, что это диспергированный повтор. В одном случае (см. Результаты, рис. ПА) нами обнаружена последовательность, содержащая две копии Squam-1, разделенных TG-богатым спейсером длиной 40 п.н. Этот спейсер может быть частью микросателлитной последовательности, в которую произошло встраивание двух элементов. Альтернативно, две близко расположенные копии могут составлять димер. Существование димерных SINEs, составленных из повторяющихся единиц одного типа, показано на примере некоторых тРНКА1а(СОС)-родственпых SINE (CHURAKOV et al., 2005), а также тРНК других типов (например, семейство CYN из генома шерстокрылов (SCHMITZ and ZISCHLER, 2003; PISKUREK et al., 2003), представленное, в основном, димерами и тримерами, а также семейство Twin из генома комара Culex pipiens (FESCHOTTE et al., 2001)). Практически у всех известных димерных и тримерных SINEs составляющие их единицы в той или иной степени отличаются между собой, в то время как в і, упомянутой последовательности Squam-2 обе копии очень сходны как по длине, так и по последовательности. Разделяющий их (TG)npaKT, возможно, является потенциально рекомбиногенным (ВОЕНМ et al., 1989; WAHLS et al., 1990). Сходная последовательность отделяет центральный консервативный регион V-SINEs от 3 -"хвоста" (OGIWARA et al., 2002). Более детальное исследование последовательностей и геномного окружения Squam-2 позволит прояснить вопрос о возможной мультимеризации этих повторов, а также уточнить структуру и функциональную значимость 3 -конца.