Введение к работе
Актуальность проблемы. Структура транскрипционно-активного хроматина остается восьма неясной d деталях. Одним из основных сопросов является определение состава хромосомных белкоп при транскрипции, таи как диссоциация одних и связывание других белков могут приводить к транскоьформации хроматина, способного транскрибироваться РНК-полимеразоЯ. Обаїепрмзнаяо, что ключевыми белками в таких трансконформациях могут быть линкерные гистоны, обеспечивающие укладку наднуклеосомннх структур хроматина, а также негистоновые бол;си высокоподвижной группы (так называемые HMG балки). Для зондирования отличий активного и неактивного хроматина использовались различные подходы: гидролиз нуклеаэами, Фракционирование хроматина седиментацией, электрофорезом, иммунопреципитациэй и др. Однако предложенные методы не обеспечивают сколько-нибудь чистых препаратов активного хроматина, а также вносят ряд артефактов, сэмьт серьезным из которых является перераспределение хромосомных белков по ДНК. Вследствие этого наблюдаются значительные расхождения как в результатах экспериментов, так и в интерпретации данных.
Цель работы. Целый настоящей работы является разработка нового методического подхода определение локальной концентрации (плотности) хромосомных белков ка специфических последовательностях генома эукариот. На подели эритроцитарного хроматина эмбрионов цыплят демонстрируется распределение, линкерных гистонов и 1IMG белков на г.тобино.вом, овальбумнновом и лизоцимсвом генах, взятых как примеры транскрибируемых и нетраьскрибируемых последовательностей.
Научная новизна. Разработан и применен метод количественного анализа плотности хромосомных белков на специфических однокопийнмх последовательностях ДНК. Метод заключается в комбинации ДНК-белковой сшивки внутри цельных клеток или на выделенных ядрах,
і і
иимунолреципитации сшитых комплексов и идентификации сшитой ':К с пемокыо дот-гибридизации с одноцепочечішни пробами. Метод был применен для количественное оценки линкерных гистоньв НІ/Н5 и HMG белков на транскрибируэмых (глобиноецх) и і ю-транскрибируемых /пмл.пьбуминовых и лизоцимовсіч) последоиательностях эритроцитарпого хронатина. Транскрибируемый хроматин характеризуется примерно 2-кратно сниженной плотностью ИІ и Н5 по срасиєнию с хроматином неактивных геноо, что подтверждено методом гибридизации с белковыми тенями" . Далее, хроматин транскрибируемых геиси характеризуется в 1.5-2.5 раза повышенной платностью '.U.C 14/17 по сравнений с неактивными генами, з то Еремя, как 1IMG 1/2 связаны ^. этими генами равноиеряо. Ь' регуляторний уч&отсх р г.чэбиисиого гена бііп обеднен всеми иссл> дованныни бе/'сами, что подразумевает резкое прерывание нуклеосомного континуума.
Об'ьем работы. Диссертация состоит из введения, обоо;:^ гитератур!^, описания методов исследования, изложения и обсуждения пепучепных результатов, шлводов и списка цитируемой тыторагуры (124 наименований). Работа изложат^ на 94 страницах машинописного текста и содзрасит 19 рисунков и 2 таблицы.