Содержание к диссертации
Введение
1. Малые ядрышковые РНК 9
1.1. C/D-семейство мякРНК 10
1.2. Н/АСА-семейство мякРНК 13
1.3. Малые РНК из телец Кахаля 15
1.4. РЫКаза Р иРНКазаМЕІР: эндонуклеазы, содержащие РНК 18
1.4.1. РНКазаР IS
1.4.2. РНКаза MRP 21
1.5. Номенклатура мякРНК 21
1.6. Гены мякРНК 22
1.6.1. Гены мякРНК позвоночных 23
1.6.2. Гены мякРНК дрожжей 23
1.6.3. Гены мякРНК растений 24
1.6.4. Гены мякРНК простейших 26
1.6.5. Гены мякРНК дрозофилы 27
1.6.6. Гены мякРНК архебактерий 27
1.6.7. Заключение 27
1.7. Гены- хозяева мякРНК позвоночных 29
1.8. Транскрипция генов мякРНК 32
1.9. Созревание и транспорт мякРНК 32
1.10. Формирование РНП 34
1.10.1. Белки C/D мякРНП 34
1.10.2. Сборка C/D мякРНП 36
1.10.3. Белки Н/АСА мякРНП 38
1.10.4. Сборка Н/АСА мякРНП 39
1.10.5. Белки, участвующие в биогенезе C/D и Н/АСА мякРНП 40
1.11. Модификации рРНК и их роль 41
1.11.1, Виды модификаций РНК у разных таксонов 41
1.11.2. Локализация 2'-0-метилированной рибозы и псевдоуридина в рРНК 42
1.11.3. Паттерны модификации отличаются у крупных систематических групп 44
1.11.4. Функции модификаций 45
2. Материалы и методы 53
2.1, Материалы, реактивы и приборы, использованные в работе 53
2.2. Работа с клетками Е. coli и выделение плазмидиой ДНК 54
2.3. Клеточные культуры 55
2.4, Фракционирование клеточного содержимого 55
2.4.1. Выделение фракций цитоплазмы, нуклеоплазмы и ядрышек 55
2.4.2. Выделение ядерной, цитоскелетной и свободной фракции 56
2.5. Анализ клеточных экстрактов на сахарозных градиентах 56
2.6, Выделение ДНК и РНК 56
2.6.1. Выделение ДНК 56
2.6.2. Выделение РНК 57
2.7. Клонирование полноразмерной копии Ш7-кДНК 57
2.8. Клонирование локуса, несущего ген U87 мякРНК 58
2.9. RACE-анализ U87HG РНК 58
2.10. Секвенирование ДНК 59
2.11. Идентификация -концов РНК методом удлинения праймера 59
2.12. Нозерн-блот анализ 59
2.13. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 60
3. Результаты 62
3.1. TJ87 РНК-новая мякРНК C/D-семейства 62
3.1.1. Обнаружение и получение полноразмерной нуклеотидной последовательности U87 РНК 62
3.1.2. Анализ нуклеотидной последовательности U87 РНК 63
3.1.3. Определение внутриклеточной локализации U87 РНК 64
3.1.4. U87PHK кодируется уникальным геном 64
3.2. U87HG - некодирующий ген-хозяин U87 мякРНК 65
3.2.1. U87PHK кодируется интроном некодирующего белок гена 65
3.2.2. Ген U87HG принадлежит к 5'ТОР семейству генов домашнего хозяйства 70
3.2.3. U87HGPHK локализована в цитоплазме и стабильна 73
3.2.4. U87HG РНК ассоциирована с рибосомами 75
3.2.5. Влияние ингибиторов трансляции на концентрацию U87HGPHK 77
3.2.6. Различный уровень ассоциации U87HG РНК и UHG РНК с рибосомами вносит вклад в их разную подверженность NMD 78
3.3. Круг распространения U87 мякРНК и ее гена-хозяина 80
3.3.1. U87PHK присутствует у позвоночных, но не у растений и дрожжей 80
3.3.2. Мишень U87 РНК расположена в консервативном участке рРНК 82
3.3.3. U87PHK не меняет гена-хозяина 84
3.3.4. Число экзонов в гене U87HG и число генов U87 РНК в его интронах может изменяться 85
3.3.5. Другие некодирующие гены- хозяева изменяются сходным образом 89
4. Обсуждение 96
4.1. C/D-мотив может формироваться в предшественнике U87 мякРНК 96
4.2. Количество и состав генов мякРНК в интронах некодирующих генов-хозяев меняется у разных систематических групп 97
4.3. Ген U87HG принадлежит к 5'ТОР семейству генов домашнего хозяйства 98
4.4. Малая подверженностьШ7НО РНК деградации может быть связана не только с низкой интенсивностью трансляции 99
4.5. Нуклеотидная последовательность U87HGPHK более консервативна по сравнению с транскриптами других некодирующих генов-хозяев 102
4.5.1. Парные и множественные выравнивания U87HG, UHG и gas5 РНК 102
4.5.2. Парные выравнивания локусов генов UHG, gas5 и U87HG 103
4.5.3. Некодирующие интроны в гене U87HG 104
4.6. Степень консервативности U87HGPHK соответствует консервативности НТО 105
4.7. Функциональность некодирующих генов-хозяев: pro et contra 105
Выводы 108
- Н/АСА-семейство мякРНК
- Белки, участвующие в биогенезе C/D и Н/АСА мякРНП
- Анализ клеточных экстрактов на сахарозных градиентах
- Количество и состав генов мякРНК в интронах некодирующих генов-хозяев меняется у разных систематических групп
Введение к работе
Значительная часть транскрибируемых последовательностей генома не кодирует белок. В последние несколько лет интерес к таким последовательностям необычайно возрос благодаря обнаружению новых классов некодирующих РНК (нкРНК). Оказалось, что нкРЫК выполняют в клетке удивительно широкий спектр функций с использованием неизвестных ранее механизмов. Они вовлечены в регуляцию транскрипции и трансляции, репрессию мобильных генетических элементов и другие регуляторные пути - процессы, участие в которых считалось ранее прерогативой белков. Описанные на сегодняшний день нкРЫК по самым разным оценкам представляют собой только вершину айсберга. Обнаружение и изучение новых нкРНК позволит выявить и исследовать неизвестные ранее механизмы работы клетки и представляет поэтому фундаментальный интерес.
Одним из классов нкРНК являются малые ядрышковые РНК (мякРНК, англ. - small nucleolar RNAs, snoRNAs). Их функция была установлена совсем недавно и заключается в определении нуклеотидов рРНК, малых ядерных РНК и мРНК, которые будут модифицированы одним из двух способов: метилированием 2'-ОЫ группы рибозы или превращением уридина в псевдоуридин. Большинство мякРНК позвоночных кодируется очень необычным способом: их гены расположены в нитронах генов белков, так что мякРНК образуются в результате сплайсинга мРНК "гена-хозяина".
К настоящему моменту получен ряд данных о том, что нарушения экспрессии мякРНК могут иметь тяжелые последствия для организма. Так, делеция генов обнаруженных недавно мякРНК (НВП-52 и HBII-85) играет существенную, если не ведущую роль в патогенезе т.н. синдрома Прадера-Вилли - наследственного заболевания человека. Поэтому обнаружение и изучение новых мякРНК может послужить первым шагом к лечению ряда тяжелых болезней, причины которых до последнего времени оставались неизвестными.
На сегодняшний день даже для картированных модифицированных нуклеотидов рРНК найдены не все мякРНК. Кроме того, далеко не все модификации клеточных РНК известны. Обнаружение новых мякРНК необходимо для создания полной картины работы клетки и для выяснения универсальности представления о том, что каждая модификация такого вида направляется мякРНК. Помимо этого, обнаружение новых мякРНК может расширить наши представления о распространении и роли модификаций, а изучение разнообразия и функций генов-хозяев позволит ответить на фундаментальный вопрос о биологическом смысле кодирования мякРНК нитронами генов и о том, случаен ли выбор гена-хозяина.
Отправной точкой для данной работы послужило исследование созданной в нашей лаборатории кДЫК-библиотеки малых РНК из альфа-РНП частиц печени крысы. Эти частицы были впервые обнаружены как компонент кислоторастворимых белков хроматина (Konstantinova et al,, 1984). К настоящему времени показано, что алъфа-РНП содержат ряд протеасомных антигенов и, очевидно, представляют собой РНК-содержащие ядерные протеасомы (Konstantinova et al., 1999). Препарат альфа-РНК бвш любезно предоставлен лабораторией И.М. Константиновой (Институт цитологии РАН). В составе альфа-РНК, помимо транскриптов короткого ретропозона ID, генов 4,5Si и 4,5Sh РНК, родственных SINEs, нами была обнаружена новая РНК, названная U87.
Цепью данной работы было изучение РНК U87 а ее гена-хозяина.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Определить, к какому семейству малых РНК относится U87 РНК.
Определить, кодируется ли U87 РНК независимым геном, интроном известного гена или интроном нового гена-хозяина. В последнем случае планировалось определить, кодирует ли ген-хозяин белок или продуцирует нкРНК и исследовать локализацию транскрипта в клетке.
Сравнить структуру и уровень консервативности нуклеотидной последовательности гена-хозяина U87 РНК и других генов-хозяев.
В результате проведенного исследования идентифицирована новая мякРНК C/D-семейства, способная направлять 2'-0-метилирование гуанилового остатка в положении 3468 28S рРНК и названная U87. Обнаружено, что U87 мякРНК кодируется интроном нового гена, названного U87HG (host gene). Этот ген относится к 5'ТОР-семейству генов "домашнего хозяйства" и у грызунов, в отличие от гена человека, имеет множественные старты транскрипции. Показано, что сплайсированная и полиаденилированиая U87HG РНК не способна кодировать белок из-за отсутствия длинных открытых рамок считывания и является, таким образом, некодирующей РНК. Фракция U87HG РНК ассоциирована с рибосомами и потому является мишенью для механизма деградации, уничтожающего в ходе трансляции мРИК с нонсенс-мутациями (nonsense-mediated mRNA decay, NMD). Однако U87HG РНК слабо подвержена NMD, что резко отличает ее от другой некодирующей РНК -UHG. Предложена модель, объясняющая такое разное поведение этих РНК.
Показано, что нуклеотидная последовательность U87HG РНК млекопитающих заметно более консервативна по сравнению с последовательностями других некодирующих генов-хозяев мякРНК, что может указывать на наличие у U87HG функции помимо продуцирования U87 мякРНК.
Впервые прослежены тенденции изменчивости некодирующих генов-хозяев у разных классов позвоночных. В ходе этого анализа обнаружены три новые мякРНК C/D-семейства и предсказаны их функции.
Полученные результаты расширяют имеющиеся данные о мякРНК, а также позволяют поставить под сомнение сложившееся представление о нефункциональности экзонных последовательностей некодирующих генов-хозяев мякРНК. Кроме того, они вносят вклад в представление о тенденциях изменений гомологичных генов у позвоночных.
Н/АСА-семейство мякРНК
Несколько видов РЩС этого семейства участвуют в разрезании пре-рРНК, выполняя, подобно C/D РНК, функцию шаперонов (U17/El/snR30, Е2, ЕЗ (Mishra & Eliceiri, 1997; Atzora et al., 2004) и дрожжевая РНК snRlO (Tollervey & Kiss, 1997)), тогда как большинство остальных направляет псевдоуридилирование рРНК (Ganot et al., 1997). Длина большинства видов PPIK семейства составляет 100 - 150 н. Все Н/АСА мякРНК имеют общую вторичную структуру, включающую в себя две шпильки и два одноцепочечных участка, один из которых расположен между шпильками, а другой - на З -конце. (т.н. "hairpin-hinge-hairpinail" структура, см. рис. За), (Ganot et al., 1997). В составе одноцепочечных участков, у основания шпилек, расположены две консервативные последовательности: первая, т.н. элемент Н, расположена у основания первой шпильки, сильно вырождена и имеет консенсус ANANNA, вторая, т.н. элемент АСА, имеет консенсус АСА, расположена у основания второй шпильки и отделена тремя нуклеотидами от З -конца мякРНК (рис. За). Оба элемента необходимы для правильного образования концов мякРНК и для формирования мякРНП (Balakin et al., 1996; Bortolin et al., 1999), а для ядрышковой локализации H/ACA мякРНК необходимы оба элемента и шпилька, расположенная между ними (Narayanan et al., 1999а). Для успешного осуществления псевдоуридилирования необходимы оба элемента и две шпильки (Bortolin et al., 1999). В составе одной или, реже, обеих шпилек расположены два комплементарных рРНК участка длиной 3-10 н. каждый. В результате комплементарного взаимодействия с пре-рРНК нуклеотид, который будет модифицирован, и еще один, примыкающий к нему с З -конца, экспонируются в образующемся одноцепочечном "окне" (Ganot et al., 1997) и таким образом становятся доступными для фермента, осуществляющего псевдоуридилирование (рис. За). В ходе реакции происходит поворот остатка урацила на 180 вокруг оси N3-C6, при этом рвется связь Ci-N и образуется новая связь C[-Cs (рис. 36). Расстояние от модифицируемого нуклеотида до бокса Н и/или АСА консервативно и составляет 14-15 нуклеотидов. Таким образом, некоторые Н/АСА мякРНК направляют псевдоуридилирование одного сайта в рРНК, а некоторые - двух. Среди Н/АСА мякРИК, как и в C/D-семействе, обнаружены РНК, направляющие псевдоуридилирование мяРНК, а также мякРНК, мишени которых неизвестны (Cavaille et al., 2000; Vitali et al., 2003; Kiss et al., 2004). Вероятно, ими тоже окажутся мРНК. К настоящему времени Н/АСА РНК известно меньше, чем C/D РНК.
Это связано с тем, что поиск последовательностей Н/АСА РНК в нуклеотидных базах данных затруднен из-за коротких и вырожденных характеристических последовательностей. Главным путем детекции этих РНК остается конструирование кДНК-библиотек малых РНК. Следует отметить, что в последнее время в этой области достигнут значительный успех (Kiss et al., 2004). 1.3. Малые РНК из телец Кахаля Недавно были обнаружены необычные C/D и Н/АСА РНК, локализованные не в ядрышке, а в т.н. тельцах Кахаля (Cajal bodies). Тельца Кахаля (ТК), или спиральные тельца (coiled bodies) - это круглые или овальные образования диаметром 0,3-0,5 мкм, присутствующие в ядре и состоящие из спиральных фибриллярных цепей, образованных главным образом белком коилином (р80 coilin), (Gall, 2000). Тельца Кахаля обнаружены у позвоночных, беспозвоночных и растений (Carmo-Fonseca, 2002), а у дрожжей аналогичная структура получила название ядрышковые тельца (nucleolar bodies, (Verheggen et al., 2001)). Число ТК зависит от типа клеток и видовой принадлежности организма и колеблется от 1 до 100 (обычно 2-5) (Raska et al., 1991). Достаточно часто они ассоциированы с ядрышком, а у дрожжей находятся внутри него (Verheggen et al., 2001). В составе ТК обнаружены все три РНК-полимеразы и факторы базальной транскрипции, а также мяРНК и мякРНК, но не найдены мРНК и рРНК (Gall et al., 1999). Благодаря этому полагают, что основная функция ТК - это созревание и сборка мяРНП, мякРНП и транскрипционных комплексов, которые функционируют затем в других отделах ядра (Gall, 2000). По месту обнаружения новые малые РНК назвали макРНК (малые РНК из телец Кахаля, англ. scaRNAs - small Cajal-body specific RNAs) (Darzacq et al., 2002). Пока их известно менее двух десятков, но, видимо, список будет продолжать расти. Две из них принадлежат к семейству C/D, одна - к семейству Н/АСА, а еще одна содержит два Н и два АСА элемента, то есть фактически состоит из двух соединенных вместе молекул Н/АСА мякРНК (Kiss et al., 2002). Еще четыре РНК имеют необычную структуру; они содержат характеристические последовательности и C/D, и Н/АСА РНК (рис. 4) (Jady & Kiss, 2001; Darzacq et al., 2002). Их длина составляет 250-350 н. Каждая такая РНК способна направлять и 2 -0-метилирование, и псевдоуридилирование и связана с белками как Н/АСА, так и C/D РНП. Все макРНК вовлечены в модификацию мяРНК (Ul, U2, U4 и U5), которые, как было показано, содержат большое количество 2 -0-метилированной рибозы и псевдоуридина (13 и 21 остаток, соответственно), (Carmo-Fonseca, 2002). Например, U85 макРНК направляет метилирование С45 и псевдоуридилирование U46 в U5 мяРНК (Jady & Kiss, 2001). Интересно, что часто одну и ту же модификацию мяРНК способны направлять две неродственные макРНК. Видимо, механизм модификации мяРНК обладает большим запасом прочности по сравнению с механизмом модификации рРНК. Интересно, что характеристический для Н/АСА мякРНК мотив, состоящий из двух шпилек и двух одноцепочечных участков с последовательностями Н и АСА, обнаружен в составе теломеразной РНК позвоночных (Mitchell et al., 1999), рис.5. Он расположен на 3 -конце теломеразной РНК и, например, у человека включает в себя 240 из 451 н. теломеразной РНК. Н/АСА-мотив теломеразной РНК связан со всеми коровыми белками Н/АСА РНП (Meier, 2005) и необходим для стабильности теломеразной РНК, а также для функционирования теломеразы in vivo (Mitchell et al., 1999).
Кроме того, Н/АСА-мотив необходим для ядерной локализации теломеразной РНК: без него она оказывается в цитоплазме (Lukowiak et al., 2001). Недавно в составе этого мотива был обнаружен САВ-бокс, характерный для макРНК. Благодаря наличию этого бокса теломеразная РНК обнаруживается в тельцах Кахаля в клетках HeLa (Jady et al., 2004; Zhu et al., 2004), хотя некоторая часть (около 10%) локализована в ядрышке (Mitchell et al., 1999; Lukowiak et al., 2001). Следует отметить, что присутствие теломеразной РНК в тельцах Кахаля характерно только для раковых клеток и не наблюдается в обычных (Zhu et al., 2004). Возможно, это связано с тем, что полноцепная обратная транскриптаза присутствует только в иммортализованных клетках, тогда как теломеразная РНК присутствует во всех клетках. Поэтому присутствие теломеразной РНК в тельцах Кахаля клеток HeLa может отражать то, что в этих органеллах происходит сборка теломеразы или что она аккумулируется в них в неактивном состоянии. Такое предположение поддерживается тем, что обратная транскриптаза локализована в ядрышке, с которым обычно тесно связаны тельца Кахаля (Etheridge et al., 2002). 1.4. РНКаза Р и РНКаза MRP: зидонуклеазы, содержащие РНК. Обе эндонуклеазы представляют собой РНП-коплексы, обладающие рядом сходных признаков. 1.4.1. РНКаза Р Эта РНКаза обнаружена у всех живых организмов, имеющих клеточное строение: эукариот, бактерий и архебактерий. У эукариот она локализована в нуклеоплазме и в меньшем количестве в ядрышке, кроме того, ее активность обнаруживается в митохондриях и хлоропластах. РНКаза Р вовлечена в удаление 5 -концевой лидериой последовательности у пре-тРНК: она осуществляет гидролиз фосфодиэфирной связи, высвобождая 5 -фосфат зрелой тРНК и З -гидроксил лидерной последовательности. У бактерий РНКаза Р участвует в разрезании предшественников еще нескольких РНК, в частности, она вовлечена в образование 4,5S рРНК (Xiao et al., 2002). Возможно, хотя до сих пор прямо не показано, что у эукариот РНКаза Р также имеет дополнительные субстраты.
Белки, участвующие в биогенезе C/D и Н/АСА мякРНП
Сборка мякРНП происходит котранскрипционно (Ballarino et al., 2005). И в сборку, и в транспорт мякРНП вовлечены вспомогательные белки, которые не связаны со зрелыми мякРНП и не необходимы для их функционирования. Пока известно менее десяти таких белков (Meier, 2005), наиболее изученные описаны ниже. С мякРНК C/D-семейства слабо ассоциированы два структурно родственных нуклеоплазматических белка: TIP48 (известный также как ТГР49Ь, RUVBL2, p50s ТАР54В и Reptin42) и TIP49 (известный также как ТГ?49а, RUVBL1, р55 и ТАР54) (Filipowicz & Pogacic, 2002). Эти белки обладают ДНК-хеликазиой активностью и вовлечены в большое количество процессов, в частности, в репарацию и транскрипцию (Newman et al., 2000). Кроме того, они вовлечены в сборку и транспорт мякРНП. В частности, дрожжевой ортолог T1P4S необходим для аккумуляции C/D и Н/АСА мякРНК, а также для ядрышковой локализации белков Noplp и Garlp - коровых компонентов мякРНП (Filipowicz & Pogacic, 2002). В ядрышке и тельцах Кахаля присутствует белок Noppl40, который курсирует между этими органеллами и мелсду ядрышком и цитоплазмой. Он взаимодействует с C/D и Н/АСА мякРНП и, видимо, участвует в их сборке и транспорте. По крайней мере, в дролоках его гомолог необходим для аккумулирования Н/АСА РНК и для удержания C/D РНК в ядрышке (Filipowicz & Pogacic, 2002). Белок SMN (survival of motoneurons), мутации в котором вызывают спинальную мышечную атрофию (spinal muscular atrophy), взаимодействует с коровыми белками C/D и Н/АСА мякРНП, фибрилларином и GAR1, и, вероятно, вовлечен в сборку мякРНП. Помимо этого SMN является одним из важнейших белков, вовлеченных в сборку РНП, которые участвуют в биогенезе рибосом, а также в сплайсинге и транскрипции (Filipowicz & Pogacic, 2002). Следует отметить, что этот таїсой важный для высших эукариот белок отсутствует в дрожжах: по крайней мере, его гомолог у них не обнаружен (Meier, 2005). В отличие от мякРНК, направляющих модификации нуклеотидов, мякРНК, участвующие в процессинге рРНК обычно ассоциированы с более многочисленным набором белков. Например, U3 РНП, участвующий в образовании 18S рРНК из предшественника, помимо четырех обычных коровых белков содержит еще один дополнительный, и некоторую часть времени связан еще по меньшей мере с семью другими белками (Filipowicz & Pogacic, 2002). Сравнительно небольшая их часть содержит измененные азотистые основания, причем каждую модификацию осуществляет отдельный фермент.
Особенно много таких нуклеотидов в тРНК, хотя они содержатся и в рРНК (здесь наиболее часто встречается метилирование азотистых оснований, в том числе псевдоуридииа) (Decatur & Fournier, 2002; The RNA Modification Database, http://medstat.med.utah.edu/RNAmods"). Однако наиболее часто в рРНК встречаются 2 -0-метилированная рибоза и псевдоуридин. У бактерий и эти модификации осуществляются каждая своим ферментом (иногда один фермент может осуществлять несколько модификаций) (Decatur & Fournier, 2002). У эукариот и архебактерий такая система работает только для тРНК, где модификации исчисляются несколькими десятками. Для рРНК и мяРНК, где по сравнению с бактериями модификаций в десятки раз больше, имеется более универсальная система гидовых мякРНК, с помощью которой осуществляется 2 -0-метилирование и псевдоуридилирование не менее полутора сотен остатков. Видимо, таким образом достигается экономия сотен ферментов. Кроме того, значительно облегчается тотальная регуляция уровня метилирования и псевдоуридилирования: достаточно только изменить экспрессию немногочисленных генов белков мякРНП, а не сотен генов, каждый из которых отвечает за модификацию одного сайта. Наконец, такая система обладает большей пластичностью: для появления нового сайта метилирования может быть достаточно лишь небольшого изменения, например, вставки одного нуклеотида между боксом D/D и антисеис-элементом (см., например, (Brown et al., 2001)). Наиболее правдоподобно этот сценарий выглядит по отношению к растениям, где большинство генов мякРНК представлены несколькими копиями, и поэтому дивергирующая копия освобождается от давления отбора. Интересно, что сами гидовые мякРНК тоже имеют модифицированные нуклеотиды, в частности, Ч (Greenwood et al., 1996). Вопрос о механизме их образования пока остается открытым. 1.11.2. Локализация 2 -0-метилированнойрибозы и псевдоуридина врРЯК За единичными исключениями (Brown et al., 2001; Liang et al., 2005), все модифицированные нуклеотиды, в том числе 2 -0-метилироваиная рибоза и псевдоуридин, расположены в консервативных участках рРНК, необходимых для нормального функционирования рибосомы (Maden, 1990). Например, видно (рис. 11 а), что большинство модификаций рРНК большой субъединицы сосредоточено в доменах И и IV, отвечающих за взаимодействие с мРНК и с антикодоном тРНК, а также в домене V, который включает в себя пептидил-трансферазный центр. На трехмерных реконструкциях субчастиц видно, что эти удаленные друг от друга в первичной и вторичной структуре домены при образовании третичной структуры оказываются рядом, причем практически все модификации располагаются на внутренней поверхности субчастиц, в месте их контакта друг с другом (Decatur & Fournier, 2002), рис. 116. Именно па внутренней поверхности субчастиц расположены все функционально важные сайты рибосомы: А, Р, Е, места контактов субъедиииц, и большая часть модифицированных нуклеотидов сосредоточена как раз в этих сайтах. Особенно много модификаций в пептидил-трансферазном центре и в канале выхода полипептида, стенки которого почти на всем протяжении образованы только рРНК. Модификации практически полностью отсутствуют на внешней поверхности и на периферии зоны контакта субчастиц и потому, очевидно, не влияют на большинство РНК-белковых контактов в рибосоме.
В частности, модифицированных нуклеотидов нет в составе сарцин-рициновой петли (SRL), с Таким образом, модификации непосредственно не влияют на связывание фактов трансляции и на транслокацию белков через мембраны (Decatur & Fournier, 2002). Хотя перечисленные закономерности являются общими для всех обладателей рибосом, паттерн модификаций достаточно сильно отличается у разных таксонов. 1.11.3. Паттерны модификации отличаются у крупных систематических групп Хотя в пределах достаточно крупного таксона (например, позвоночных), паттерн модификации рРНК существенно не меняется, между таксонами такого ранга паттерны отличаются достаточно сильно. Прежде всего, различно число модифицированных нуклеотидов (Таблица 2). Так, у дрожжей и позвоночных число 2 -0-метилированных и псевдоуридилированных нуклеотидов отличается примерно в два раза, а у растений по сравнению с позвоночными этих модификаций еще больше (Таблицы 2 и 3). Кроме того, различаются сами сайты модификаций: хотя многие из них консервативны у двух и даже более таксонов, значительное число является таксон-специфичными. Например, более 70% 2 -0-метилированных нуклеотидов позвоночных и растений отсутствуют у дрожжей (Таблица 3) и только половина метилированных нуклеотидов у позвоночных и растений общие, У трипаносом {Trypanosoma brucei) из 84 предсказанных сайтов метилирования (на самом деле их, видимо, не менее 100) 40 не встречаются у человека, растений и дрожжей (Liang et а]., 2005), Наконец, специфичные сайты модификации имеются даже у каждого из двух, впрочем, достаточно далеких (относящихся к разным классам), видов дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Schizosaccharomyces pombe (Li et al., 2005). Соответственно различаются и наборы мякРНК. Паттерны метилирования различаются и в более тонких деталях. Так, у разных таксонов присутствует разное количество сайтов, содержащих два и даже три метилированных нуклеотида подряд ( 25S рРНК пшеницы содержит восемь сайтов с тремя метилированными нуклеотидами подряд, a 28S рРНК человека имеет только один такой сайт и два сайта с двумя метилированными нуклеотидами подряд. 25 S рРНК дрожжей содержит четыре сайта с двумя метилированными нуклеотидами подряд, причем только два из них соответствуют аналогичным сайтам человека (Maden, 1990; Lowe & Eddy, 1999; Samarsky & Foumier, 1999)). Кроме того, у трипаносом небольшое число модификаций располагается вне зоны контакта субъединиц, что нехарактерно для остальных таксонов (Liang et al., 2005). Такое разнообразие паттернов модификации удивительным образом контрастирует с консервативностью структуры рибосом.
Анализ клеточных экстрактов на сахарозных градиентах
Клетки HeLa или SC1 (2х107) обрабатывали циклогекеимидом в низкой концентрации (0,05 мкг/мл) в течение 30 мин. для того, чтобы усилить трансляцию 5ТОР мРНК. К этим же клеткам за 5 мин. до сбора добавляли циклогексимид в концентрации 100 мкг/мл. В другом опыте клетки HeLa или SC1 обрабатывали ингибитором инициации трансляции фторидом калия KF (30 мМ) в течение 30 мин. В качестве контроля использовали необработанные клетки HeLa или SC1. Клетки отмывали один раз холодным PBS (4С), соскребали с чашек, суспендировали в 20 мл холодного PBS и центрифугировали в течение 5 мин. при 430 g и 4С. Далее все операции проводили на льду. Клетки гомогенизировали в 2 мл лидирующего буфера (50мМ Tris-HCl, рН 8,0 - 0,1 М NaCl - 5 мМ MgCl2 - 0.5% NP40 - 2000 ед. RNAsin) 15 ходами плотно притертого пестика в гомогенизаторе Даунса. На этой стадии к лизатам добавляли соответственно циклогексимид (100 мкг/мл) или KF (30 мМ). К лизатам, полученным из контрольных клеток, добавляли ЭДТА (10 мМ) или не добавляли ничего. После 2 мин. инкубации лизаты центрифугировали 15 мин. при 12000 g и 4С. Ко всем супернатантам добавляли гепарин (0,1 мг/мл). По 1 мл супернатантов наслаивали на 10 - 50% линейные сахарозные градиенты, приготовленные на (50 мМ Tris-HCl, рН 8,0 - 0,1 М NaCl -5 мМ MgCl2 - 0,1 мг/мл гепарина). При этом градиенты, предназначенные для обработанных разными реагентами лизатов, содержали дополнительно 100 мкг/мл циклогексимида, 30 мМ KF и 10 мМ ЭДТА соответственно. Центрифугирование проводили в течение 15 ч при 4С и 23000 оборотов/мин в роторе SW40 (Beckman). Градиент разделяли на фракции (20) через тонкую трубку, опущенную на дно центрифужной пробирки. Измеряли оптическую плотность (D2UO) полученных фракций, после чего из них выделяли РНК экстракцией смесью фенола с хлороформом (1:1). 2.6. Выделение ДНК и РНК 2.6.1. Выделение ДНК Печень растирали в ступке с жидким азотом, получившийся порошок суспендировали в буфере (Трис-HCl, рН 8,0 - ЮОмМ NaCl - 25мМ ЭДТА), добавляли SDS до 1% и протеииазу К до 200 мкг/мл и инкубировали при 50С в течение 2-4 ч. Затем проводили депротеинизацию, экстрагируя лизат смесью (1:1) хлороформа и фенола, насыщенного Трис-НС1, рН 8,5. ДНК осаждали 1 объемом изопропанола и переосаждали этанолом. 2.6.2. Выделение РНК Для выделения РНК цитоплазматические фракции депротеинизировали смесью (1:1) хлороформа и фенола, насыщенного Трис-НО, рН 8.5. К фракциям нуклеоплазмы, ядрышек или ядер добавляли SDS до 1% и CH3COONa, рН 5,0 до 0,2М. Затем добавляли равный объем фенола, рН 5,0 и инкубировали 10 минут при 65 С, постоянно перемешивая.
Охлаждали во льду и центрифугировали 10 минут со скоростью 4000 об./мии. Отбирали водную фазу и вновь добавляли фенол как описано выше. Затем РНК осаждали добавлением к водной фазе 2,5 объемов этанола. Суммарную клеточную РНК выделяли с помощью гуанидин-изотиоцианатного метода (Chomczynski & Sacchi, 1987). Поли(А)+ РНК получали, используя хроматографию на колонках с олиго (аТ)-целлюлозой в соответствии с рекомендациями производителя ("Pharmacia"). 2.7. Клонирование полноразмерной копии 1187-кДНК Суммарную РНК печени крысы (150 мкг) разделяли электрофорезом в 6% ЇЇААГ с 7 М мочевиной и с помощью маркеров молекулярного веса определяли, в какой зоне геля содержится US7 РНК. Материал из этого участка переносили на ДЭАЭ-мембрану с помощью полусухого электроблотинга. РНК элюировали с мембраны в растворе (1М NaCl - 10 мМ Tris-HCl, рН 7,5 - 1 мМ ЭДТА) в течение 20 мин. при 60С. Выделенную РНК полиаденилировли с помощью поли(А)-полимеразы и синтезировали кДЫК, используя обратную транскриптазу M-MLV и праймер: 5 GTCGACTCTAGATTTTTTTTTTTTTTT (XbaI(T)i5, сайт Xbal подчеркнут). После очистки кДНК от олигонуклеотида с помощью электрофореза в 4%-ном агарозиом (NuSieve) геле, электропереноса на ДЭАЭ-мембраиу и элюции, на З -конце синтезировали олиго(сЮ), используя терминальную дезоксииуклеотидил-трансферазу. кДНК амплифицировали посредством ПЦР с праймерами XbaI(T)i5 и 5 CGGAATTCGTCCCCCCCCCC (EcoRI(C),0, сайт ЕсоШ подчеркнут). Двухцепочечную кДНК обрабатывали рестриктазами Xbal и ЕсоШ., очищали электрофорезом в 4%-ном агарозиом (NuSieve) геле и клонировали в плазмидном векторе (pGEMVZf), обработанном теми же рестриктазами. Для скрининга клонотеки использовали гибридизацию с меченой 32Р 1187-кДНК (см. раздел 2.12.). Геномные ДНК (100 мкг) крысы и мыши обрабатывали рестриктазами EcoRl и НіпдШ, разделяли электрофорезом в 0,8% агарозном геле, элюировали фракции, обогащенные искомыми фрагментами ДНК, и клонировали в плазмиде pSLl 190. В предварительном опыте с помощью блот-гибридизации по Саузерну было показано, что соЫУЯшсЦП-фрагменты ДНК крысы и мыши, содержащие ген U87 мякРНК, имеют соответственно длину 3,0 и 3,5 т.п.н. Проведя гибридизациоиный скрининг 40000 и 50000 клонов геномной ДНК крысы и мыши, выявили соответственно два и один позитивных клона. 2.9. RACE-анализ U87HGРНК Поли(А)+РНК из печени крысы и клеток человека HeLa подвергали обратной транскрипции с помощью обратной транскриптазы M-MLV и праймера XbaI(T)!5. Полученную кДНК очищали от олигонуклеотида электорофорезом в 4% агарозном геле (NuSieve). Перед 5 -RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) на З -коыце кДНК синтезировали onHro(dG), используя терминальную дезоксинуклеотидил-трансферазу. Для 5 -RACE кДНК крысы в ПЦР использовали праймеры EcoRI(C)io и Rat4Xho (Таблица 4). Также проводили амплификацию 5 -концевой области U87HG РЫК с помощью праймеров EcoRI(C)!0 и 5 TTGTTGCACCTGGAAGAGCC (в этом случае ПЦР-продукты клонировали в векторе pGEM; при отборе позитивных клонов в качестве зонда использовали Р-меченый по 5 -концу олигонуклеотид 5 CCGCCACGTAGCTCAACATG.
Мечение осуществляли как описано в разделе 2.11., но использовали 10 пм олигонуклеотида). Для З -RACE кДНК крысы проводили два раунда ПЦР: первый с использованием праймеров XbaX(T)i5 и RatlXho (Таблица 4), во втором раунде праймер RatlXho заменяли на праймер 5 AGAATTCTGAGGGTGCTTGAGCA (EcoRratl , сайт ЕсоШ подчеркнут). Праймеры были подобраны так, чтобы продукты 5 - и З -RACE перекрывались. Использовали также праймеры XbaI(T)i5 и 5 TGGATCCGAACGGAAGCAAATGGTG (BamRat, сайт ВатШ подчеркнут). В этом случае при отборе позитивных клонов в качестве зонда использовали 32Р-меченый по 5 -концу олигонуклеотид 5 TCTACATAACATATTGATACCAAA (мечение осуществляли как описано в разделе 2.11., но использовали 10 пм олигонуклеотида). Для З -RACE кДНК человека проводили два раунда ПЦР: первый с использованием праймеров XbaI(T)i5 и 5 TGGCATGCAGCATTTTGA (HumDirl), во втором раунде праймер HumDirl заменяли на праймер BamHuraDir2 (Таблица 4). ПЦР-продукты обрабатывали одной из пар рестриктаз (ЕсоШ и Xiw\, Xbal и ВатШ. или Xbal и XhoT) в зависимости от наличия соответствующих сайтов в использованных праймерах, очищали электрофорезом в 4%-ном агарозном (NuSieve) геле и клонировали в плазмиде pBS(SIC) , предварительно разрезанной одной из перечисленных пар рестриктаз. Скрининг клонотек проводили с использованием гибридизации с зондами, специфичными к U87HG человека или крысы (см. раздел 2.12). 2.10. Секеенироеание ДНК Клонированные фрагменты ДИК секвенировали, используя двухцепочечнуго плазмидную ДНК, стандартные М13 (прямой и обратный) прайм еры или специфические праймеры, [a- P]dATP или [а- PJdATP и дидезоксинуклеотидный метод. Один из двух наборов реактивов, основанных на Taq-полимеразе ("Силекс-М", Россия) или секвеназе версии 2,0 ("USB-Amersham", Англия), применяли согласно протоколу производителя. Нуклеотидиые последовательности U87 мякРНК крысы, U87HG РИК человека и крысы, а также локуса гена U87 РНК мыши и крысы зарегистрированы в GenBank под номерами AF272707, AY264285, AY264286, AF396686 и AF396685 соответственно.
Количество и состав генов мякРНК в интронах некодирующих генов-хозяев меняется у разных систематических групп
Показано, что у всех исследованных позвоночных U87 РНК кодируется интроном нового не кодирующего белок гена, названного U87HG. Обнаружено, что у немлекопитающих происходит увеличение количества экзонов U87HG и числа копий U87PHK в его интронах. Сходная тенденция продемонстрирована для двух других некодирующих генов-хозяев мякРНК: UHG и gas5. Для этих двух генов отмечены также множественные перестановки генов мякРНК в интронах и тенденция к потере некоторых мякРНК и к приобретению других мякРНК. При этом в их интронах обнаружены гены трех новых мякРНК C/D-семейства и предсказаны их функции. В связи с изложенными данными возникает вопрос, случайно ли распределение мякРНК среди генов-хозяев: почему именно эти мякРНК кодируются генами U87HG, UHG и gas5, с чем связана смена несколькими мякРНК гена-хозяина, имеет ли значение меняющийся порядок расположения генов мякРНК в интронах. Наконец, случайно ли наблюдаемое для всех трех генов-хозяев увеличение копий многих мякРНК у немлекопитающих. В случае птиц это можно было бы объяснить более активным метаболизмом и, соответственно, большей интенсивностью трансляции и потребностью в рибосомах. Однако это объяснение явно не подходит для холоднокровных, у которых эффект увеличения копий выражен наиболее ярко. Может быть, у них он, напротив, призван компенсировать пониженную интенсивность транскрипции генов-хозяев, которая может являться следствием менее активных обменных процессов. Возможно, в таком случае более экономной стратегией будет приобретение нескольких копий геиа мякРНК. Однако наиболее вероятным представляется следующее объяснение. По сравнению с млекопитающими, яйцеклетки рыб, амфибий и птиц гораздо крупнее и требуют большего количества рибосом. Один из способов достижения этого заключается в приобретении многих копий генов, кодирующих компоненты трансляционного аппарата. Возможно, именно этим объясняется феномен увеличения количества копий генов мякРНК у не-млекопитающих. Следует отметить, что, например, у амфибий число копий генов 5S рРНК и тРНК превышает их число у млекопитающих по меньшей мере в десять раз (количество копий гена 5S рРНК составляет 24000 у X. laevis и 2000 у человека), причем это увеличение связывают именно с большим размером их яйцеклеток (Рэфф и Кофмен, 1986; Тимофеева и др., 1993). 43. Ген U87HG принадлежит к 5 ТОР семейству генов домашнего хозяйства U87HG экспрессируется в широком спектре тканей грызунов и человека и является, таким образом, геном домашнего хозяйства (Lercher et al., 2002).
Такая ситуация соответствует ожиданиям, поскольку ген U87HG кодирует по меньшей мере один важный для клетки продукт, а именно, US7 мякРНК, которая участвует в биогенезе рибосом. U87HG РНК человека, набор транскриптов гена U7HG мыши и крысы и, очевидно, значительная часть транскриптов гена U7HG у остальных исследованных видов начинаются с пиримидинового остатка, расположенного внутри пиримидиновой последовательности, за которой следует GC-богатая область. Это достаточно необычно, поскольку большинство мРНК начинаются с пуринового нуклеотида. Такое строение 5 -концевой области мРНК характерно для т.н. 5 ТОР группы генов домашнего хозяйства. Эта группа включает в себя главным образом гены, вовлеченные в трансляцию и ее регуляцию, например, гены рибосомных белков и факторов трансляции eEFIA и eEF2 (Amaldi & Pierandrei-Amaldi, 1997). К этой группе также относятся многие гены-хозяева мякРНК (Pelczar & Filipowicz, 1998). Поскольку большинство мякРНК участвует в модификации рРНК, было высказано предположение, что такая организация позволяет координировано экспрессировать гены, необходимые для процесса трансляции (Maxwell & Fournier, 1995). Подобно другим 5 ТОР РНК, U87HG РНК транслируется не очень эффективно: в клетках человека HeLa и в мышиных клетках SC1 с рибосомами ассоциироваио примерно 20% US7HG РНК. В среднем только 25-65% 5 ТОР мРНК (в зависимости от стадии клеточного цикла) обнаруживаются в связи с рибосомами, тогда как для других мРНК генов домашнего хозяйства эта величина составляет около 90% (Amaldi & Pierandrei-Amaldi, 1997). После обработки клеток низкими концентрациями циклогексимида, вызывающими замедление элонгации, доля связанной с рибосомамиЦ"87НО РНК, как и других 5 ТОР РНК (Agrawal & Bowman, 1987; Pierandrei-Amaldi et al., 1991), возрастает. Таким образом, на основании строения 5 -концевой области, спектра экспрессии и распределения в клетке ген U87HG может быть отнесен к 5 ТОР-семейству генов домашнего хозяйства, 4.4. Малая подверогсенностьи871Ю РНК деградации может быть связана не только с низкой интенсивностью трансляции Известно, что после сплайсинга за 20-24 н. до границ экзонов на мРНК остаются белковые комплексы - так называемые exon-junction complexes, EJCs (Le Ніг et al,, 2000). В ходе первого раунда трансляции они удаляются рибосомами (Dostie & Dreyfuss, 2002). Однако если мРНК содержит нонсенс-мутацию, то трансляция терминируется преждевременно, и один или несколько EJCs остаются связанными с мРНК. РНК с такими комплексами узнается белками системы NMD (nonsense-mediated mRNA decay), часть которых связана с пост-терминировавшей 40S субчастицей, и деградирует (Maquat, 2004). Как правило, деградацию вызывают только стоп-кодоны, расположенные более чем за 50-55 н. до границы экзонов (Cheng et al, 1994; Thermarm et al., 1998). В противном случае аберрантная мРНК оказывается иммунной к NMD. Обработка клеток ингибиторами трансляции делает работу системы NMD невозможной (Wagner & Lykke-Andersen, 2002). Поэтому подверженные NMD РНК накапливаются, когда трансляция иыгибирована (Мепоп & Neufeld, 1994; Carter et al„ 1995; Noensie & Dietz, 2001). Поскольку U87HG РНК содержит множественные стоп-кодоыы и связана с рибосомами, она должна быть подвержена NMD и, соответственно, ее количество должно возрастать после остановки трансляции.
Однако значительного накопления U87HG РНК после иигибироваыия трансляции не происходит. В то же время уровень UHG РНК, которая так же, как и US7HG РНК, транслируется, сильно возрастает, как сообщалось ранее (Tycowski et al, 1996). Такое разное поведение этих двух РНК может быть вызвано либо тем, что UHG более интенсивно транслируется, либо тем, что U87HG РНК при трансляции меньше подвержена NMD. Мы показали, что фракция U87HG РНК, ассоциированная с рибосомами, в два раза меньше аналогичной фракции UHG РНК. Таким образом, U87HG РНК по сравнению с UITG РНК транслируется менее эффективно. Эта разница в интенсивности трансляции, очевидно, вносит вклад в то, что после ингибирования трансляции U87HG РЫК накапливается в гораздо меньшей степени, чем UHG РНК. Как было отмечено выше, мРНК с нонсенс-мутациями уничтожаются NMD после первого раунда трансляции. Скорость трансляции достаточно велика: у эукариот в ходе элонгации кодон прочитывается за 0,1-0,5 с (Spirin, 1999). Таким образом, все молекулы U87HG РНК (так же, как и UHG РНК), присутствующие в клетке в данный момент, должны подвергнуться трансляции за время значительно меньшее, чем 4ч. Поэтому после ингибирования трансляции в течение 4 ч можно ожидать многократного увеличения концентрации U87HG РЫК. Однако уровень U87HG РНК изменяется незначительно. Вероятным объяснением может служить то, что низкая чувствительность U87HG РНК к NMD вызвана не только относительно низким уровнем ее трансляции. Меньшая подверженность U87HG РНК NMD может быть связана с реинициацией трансляции на следующих за первой ОРС рамках. Показано, что реинициация трансляции способна нивелировать эффект NMD (Zhang & Maquat, 1997). Вообще реинициация трансляции у эукариот не является редким событием: около 40% клеточных мРНК содержат одну или несколько коротких ОРС, за которыми следует основная рамка (Peri & Pandey, 2001). Как правило, эти короткие рамки кодируют пептиды длиной до 100 аминокислот (Child el" al., 1999; Yamashita et al., 2003). Для того чтобы транслировать основную рамку, рибосома вынуждена реинициировать трансляцию, причем часто неоднократно. Эффективность реинициации обычно не очень велика и зависит от множества факторов. Среди наиболее важных - размер ОРС: с его увеличением эффективность быстро снижается.
