Введение к работе
Актуальность темы. Эндонуклеазы рестрикции узнают в ДНК короткую (4-8 н.п.) специфическую последовательность и расщепляют ДНК по двум цепям в фиксированном положении относительно узнаваемой последовательности. Эндонуклеазы рестрикции - одно из наиболее многочисленных семейств, насчитывающее около 3900 биохимически охарактеризованных представителей и приблизительно такое же количество, существование которых предсказано на основе биоинформационного анализа последовательностей ДНК, представленных в GenBank. Это чрезвычайно быстро эволюционирующее семейство, что проявляется в необычном разнообразии стратегий, используемых эндонуклеазами рестрикции для расщепления ДНК по двум цепям. Так, эндонуклеазы рестрикции, узнающие симметричную (палиндромную) последовательность, взаимодействуют с этой последовательностью в виде гомодимера. Эндонуклеазы рестрикции, узнающие несимметричную последовательность, часто взаимодействуют с ней в виде мономера, однако расщепление ДНК происходит только после димеризации мономеров, связанных с двумя разными копиями сайтов.
В последние годы были выявлены два новых типа эндонуклеаз рестрикции — двухсайтовые и гетеродимерные. Двухсайтовые эндонуклеазы рестрикции взаимодействуют с ДНК в виде мономера, который содержит два каталитических центра. Один каталитический центр расщепляет верхнюю цепь ДНК, другой - нижнюю. Гетеродимерные эндонуклеазы рестрикции состоят из двух различных субъединиц, каждая из которых содержит по одному каталитическому центру и каждая из которых расщепляет «свою» цепь ДНК.
Двухсайтовые и гетеродимерные эндонуклеазы рестрикции явились основой для конструирования нового типа' ферментов - никующих эндонуклеаз. Эти эндонуклеазы, подобно эндонуклеазам рестрикции, узнают в ДНК короткую специфическую последовательность и, подобно же эндонуклеазам рестрикции, расщепляют ДНК в строго фиксированном положении относительно узнаваемой последовательности. Но в отличие от
эндонукулеаз рестрикции никующие эндонуклеазы расщепляют только одну из цепей ДНК. Никующие эндонуклеазы стали важным инструментом молекулярной биологии. На их основе уже создан ряд новых биотехнологических методов. Предполагается, что некоторые проблемы нанотехнологий на основе ДНК могут быть решены с применением этих ферментов.
Никующие эндонуклеазы были открыты вначале как самостоятельные
ферменты. Предполагалось, что они являются природно мутировавшими
эндонуклеазами рестрикции, которые утратили способность к димеризации и,
как следствие, способность расщеплять ДНК по двум цепям. В представленной
работе впервые показано, что никующие эндонуклеазы являются одной из
субъединиц (большой) гетеродимерных эндонуклеаз рестрикции. Настоящая
работа посвящена изучению свойств и определению пространственной
структуры малой субъединицы гетеродимерной эндонуклеазы рестрикции
BspD6I. '
Цель работы: Выяснение функции белка, кодируемого открытой рамкой считывания, прилегающей к гену никующей эндонуклеазы в геномной ДНК Bacillus species D6.
Задачи работы:
-
Клонирование открытой рамки считывания, прилегающей к гену никующей эндонуклеазы в хромосомной ДНК Bacillus species D6.
-
Получение штамма-суперпродуцента белка, кодируемого открытой рамкой считывания (малой субъединицы).
-
Выявление специфичности и функциональных особенностей малой субъединицы.
-
Определение пространственной структуры малой субъединицы. Выявление структуры ее каталитического центра.
Научная новизна. Определена функция белка, кодируемого открытой рамкой считывания. Показано, что он является малой субъединицей гетеродимерной эндонуклеазы рестрикции BspD6I. Впервые показано, что никующая эндонуклеаза BspD6I - это не природно мутировавшая эндонуклеаза рестрикции, а одна из субъединиц гетеродимерной эндонуклеазы рестрикции BspD6I.
Получены кристаллы и определена с разрешением 1.5 А пространственная структура малой субъединицы, в которой выявлены
аминокислотные остатки, формирующие ее каталитический центр.
і Практическая значимость работы. Эндонуклеазы рестрикции в свое
время легли в основу техники рекомбинантной ДНК и продолжают оставаться
ее незаменимым инструментом. Обнаружение новой эндонуклеазы рестрикции
BspD6I расширяет возможности генно-инженерных методик.
Охарактеризованная в работе эндонуклеаза рестрикции BspD6I позволит
использовать ее не только как эндонуклеазу рестрикции, но и как никующую
эндонуклеазу.
Апробация работы н публикации: материалы диссертации были доложены на 11-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2007) и на международной конференции "24 European Crystallographic Meeting", (Марракеш, Марокко, 2007).
По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 статьи в реферируемых журналах.
Структура и объем диссертации: Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 115 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 22 рисунка. Список литературы содержит 120 ссылок.
