Содержание к диссертации
Список сокращений 3
Введение 4
Актуальность проблемы 4
Цели и задачи работы 6
Научная новизна и практическая ценность работы 6
Обзор литературы 8
Бактериофаг Т4 8
Продукт гена 9 10
Продукт гена 11 12
Базальная пластинка бактериофага Т4 14
Структурная реорганизация базальной пластинки при инфицировании 18
Морфогенез базальной пластинки 21
Фолдинг белка 25
Две гипотезы механизма сворачивания полипептидной цепи 25
Гипотеза нуклеации и роста 26
Сворачивание с образованием кинетических интермедиатов 27
Фолдинг белка в клетке 28
Пост-и ко-трансляционный фолдинг 28
Шапероны 29
Роль рибосомы в ко-трансляционном фолдинге 30
Ферменты, ускоряющие процесс сворачивания 30
Изучение фолдинга хвостового шипа бактериофага Р22 Salmonella typhimurium..32
Свойства хвостового шипа 32
Термолабильные интермедиаты фолдинга и образование телец включения 36
Температуро-чувствительные мутации, приводящие к нарушению фолдинга...37
Супрессорные мутации 39
Изучение рефолдинга белка in vitro 40
Побочные интермедиаты и тельца включения, исследуемые in vitro 42
Формирование нативного тримера из телец включения 42
Фолдинг БХШ определяет температуру инфицирования фага 43
Временные дисульфидные связи в протримере 43
Изучение хвостового шипа с помощью моноклональных антител 44
Различие между путями фолдинга in vivo и in vitro 45
С-домен необходим для тримеризации шипа 46
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 47
Бактериальные штаммы 47
Среды для выращивания бактерий и бактериофагов 48
Приготовление компетентных клеток 48
Трансформация компетентных клеток Е. coli плазмидной ДНК 49
Экспрессия рекомбинантных белков в клетках Е. coli BL21(DE3) 49
Приготовление экстрактов клеток, содержащих рекомбинантные белки 50
Амбер-мутанты фага Т4 50
Приготовление дефектных частиц фага Т4 51
Комплементация in vitro 51
Выделение и очистка рекомбинантных белков 52
Электрофорез белков в полиакриламидном геле 52
Иммуноблоттинг 53
Гель-фильтрация 53
Векторы для клонирования 54 Конструирование плазмидных векторов 54
Выделение и очистка плазмидной ДНК 54
Полимеразная цепная реакция 54
Очистка фрагментов, амплифицированных с помощью ПЦР 56
Клонирование фрагментов гена 11 56
Клонирование гена 9 для экспрессии мутанта nr9 FG 57
Конструирование векторов для ко-экспрессии пг9 и его делеционных вариантов 58 Конструирование плазмидных конструкций для экспрессии мутантов пг9 с
заменами Gln282 58
Конструирование плазмидной конструкции для экспрессии мутанта с заменой
Glnl70- Pro 59
Конструирование плазмидных конструкций для экспрессии мутантов пг9 с
заменами в области Glu245-Glu248 59
Конструирование плазмидных конструкций для экспрессии мутантов пгі 1 с
заменами в области Asn203-Gln205 60
РЕЗУЛЬТАТЫ 62
Комплементация дефектных частиц фага продуктами генов 9 и 11 62
Изучение продукта гена 9 бактериофага Т4 63
Мутагенез N-концевого сегмента пг9 64
Мутант nr9 FG 67
Ко-экспрессия пг9 и его делеционного варианта NA20 68
Ко-экспрессия пг9 и его делеционных вариантов NA54, NA167 и СД113 72
С-концевые делеционные мутанты пг9 74
Мутагенез Gln282 в молекуле пг9 75
Супрессорный мутант пг9 77
Изучение продукта гена 11 бактериофага Т4 78
Получение делеционных фрагментов пгі 1 78
Тримеризация делеционных фрагментов пгі 1 79
Биологическая активность делеционных фрагментов пг 11 81
Образование комплексов пгЮ с делеционными фрагментами пгі 1 82
Локализация участка взаимодействия с пгі 1в молекуле пгЮ 84
Мутагенез предполагаемых участков взаимодействия пг9 и пгі 1 с хвостовыми
фибриллами 86
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 88
Функциональная роль N-домена пг9 88
Роль С-домена пг9 90
Свойства пг11 92
Заключение 93
Выводы 95
Список литературы 97
Введение к работе
Вирусы бактерий (бактериофаги) явились основными модельными объектами, изучение которых определило успешное развитие многих направлений молекулярной биологии. Большинство основополагающих достижений, начиная с установления биологической роли ДНК, расшифровки генетического кода и кончая выяснением молекулярных механизмов экспрессии генома, практически полностью связано с бактериофагами. Их исследование также играет важную роль при изучении структурно-функциональной организации биомолекул и механизмов сборки сложных надмолекулярных биологических комплексов и вирусов (Hohn et al, 1974; Kaiser et al, 1974; Kikuchi and King, 1975a; Wood, 1974).
Классическим объектом молекулярной биологии на протяжении уже нескольких десятков лет является бактериофаг Т4. Частица Т4 состоит из капсида с геномной ДНК и сократимого хвоста; на дистальном конце хвоста находится базальная пластинка, к которой присоединены хвостовые фибриллы. На сегодняшний день - это одна из самых эффективных биологических молекулярных машин по доставке генетической информации в клетку. Высокая эффективность инфицирования, равная 1, обусловлена сложной структурой аппарата инфицирования. Базальная пластинка - контрольный центр инфекционное™ вируса - является мультибелковой структурой и контролирует узнавание клетки-хозяина, прикрепление к ней вируса, сокращение хвостового чехла и введение геномной ДНК фага в бактерию. В процессе инфицирования происходит структурная реорганизация базальной пластинки из формы гексагона в шестилучевую звезду.
В нашей лаборатории методами рентгеноструктурного анализа были решены пространственные структуры ряда белков фага Т4. Сравнительно недавно на основе изображений криоэлектронной микроскопии реконструированы отдельные компоненты фаговой частицы с высоким разрешением: капсид (Fokine et al, 2004), хвост (Kostyuchenko et al, 2005; Leiman et al, 2004) и базальная пластинка (Kostyuchenko et. al, 2003, 2005). В результате реконструкции базальной пластинки в двух конформациях (гексагон и звезда) и последующего встраивания белков с известной атомной структурой были получены две модели, сравнение которых позволило представить, как вирус инфицирует клетку (Leiman et al, 2004). Механистическое представление процесса инфицирования и полученные структурные данные явились основой для проведения направленного мутагенеза отдельных генов с целью более глубокого понимания принципов и уточнения деталей функционирования машины инфицирования фага Т4.
Настоящая работа посвящена изучению продуктов генов (пг) 9 и 11 -структурных белков базальной пластинки, прикрепляющих к ней длинные и короткие хвостовые фибриллы, соответственно. Пг9 играет ключевую роль в инициации процесса инфицирования: передаёт сигнал с длинных хвостовых фибрилл на белки базальной пластинки, приводя к её структурной реорганизации. Кроме того, пг9 и пг11 являются хорошими моделями для изучения фолдинга и олигомеризации сложных многодоменных белков. Выяснение принципов укладки полипептидных цепей в нативную пространственную структуру является одной из самых актуальных проблем молекулярной биологии и имеет важное практическое значение для биотехнологии и медицины. Цели и задачи работы
Целью настоящей работы явилось выяснение роли отдельных доменов пг9 и пгі 1 в механизме инфицирования бактериофага Т4. Задачи исследования:
1. Получить делеционные варианты nrll, а также мутанты пг9 с заменами отдельных аминокислотных остатков.
2. Изучить свойства точечных мутантов и различных N-концевых и С-концевых делеционных вариантов пг9 и пгі 1.
3. Сконструировать векторы для ко-экспрессии полноразмерного пг9 и его делеционных вариантов с удалённым N-концевым сегментом, N-, NM- и С-доменами. Изучить свойства продуктов ко-экспрессии.
4. Провести мутагенез предполагаемых областей взаимодействия пг9 и пгі 1 с фибриллами.
Научная новизна и практическая ценность работы
В настоящей работе показано, что белок базальной пластинки фага Т4 - пг9 -встраивается в нее своим N-доменом. Доказано, что для передачи сигнала на базальную пластинку в процессе инфицирования важна интактность N-домена пг9. Получены дополнительные доказательства того, что С-домен ответственен за тримеризацию пг9. Показано, что тримеризация пг9, скорее всего, происходит пост-трансляционно. С-концевые аминокислотные остатки Gln282, Lys283 и Ие284 играют важную роль в стабилизации тримера белка. Впервые для пг9 были получены температуро-чувствительные мутации ( мутации), влияющие на фолдинг и прочность ассоциации мономеров в тримере. Более того, выявлена мутация, супрессирующая температуро-чувствительный эффект мутаций. Для nrll, в отличие от пг9, первые 17 аминокислотных остатков (а.о.) с N-конца не влияют на олигомеризацию и функциональную активность белка. Однако более протяжённые делении, вплоть до полного удаления N-концевого домена, хоть и не влияют на способность белков к тримеризации, приводят к потере их биологической активности за счёт существенного нарушения структуры. Было показано, что N-концевая область тримера nrll взаимодействует с центральной областью тримера пгЮ in vitro. Возможно, именно с этого взаимодействия двух белков начинается сборка базальной пластинки в процессе морфогенеза частицы фага Т4 in vivo.
Полученные результаты позволяют дополнить существующие на сегодняшний день представления о механизме инфицирования бактериофага Т4. Обзор литературы
Бактериофаг Т4
Бактериофаг Т4 Escherichia coli является хорошей моделью молекулярной биологии и широко используется при изучении механизмов, контролирующих сборку и морфогенез биологических структур (Kellenberger, 1990; Leiman et al, 2003a). Фаг T4 обладает одним из самых сложно устроенных вирионов и состоит из капсида (длиной 1195А и шириной 860А) с геномной ДНК, сократимого хвоста (длиною ЮООА и диаметром 210А) и базальной пластинки, к которой прикреплены хвостовые фибриллы (рис. 1). Геном этого фага имеет размер 168903 пар оснований (п.о.) и содержит 289 открытых рамок считывания, кодирующих белки; 8 генов, кодирующих тРНК, и как минимум два гена, кодирующих небольшие РНК с неизвестными функциями (Miller et al, 2003). Бактериофаг Т4 обладает эффективностью инфицирования равной 1, скорее всего за счёт сложной структуры аппарата инфицирования: хвоста и базальной пластинки, к которой присоединены длинные и короткие хвостовые фибриллы. Коннекторами длинных и коротких хвостовых фибрилл являются продукты генов 9 и 11, соответственно. Пг9 И ПГІ1 являются удобными экспериментальными моделями для изучения фолдинга И олигомеризации сложных многодоменных белков, одной из важнейших фундаментальных проблем клеточной биологии, которая имеет принципиальное значение для развития белковой инженерии и биотехнологии.
Похожие диссертации на Механизм инфицирования бактериофага Т4: функциональная роль доменов продуктов генов 9 и 11
