Содержание к диссертации
Список сокращений 2
1. Введение. Цели и задачи исследования 7
2. Обзор литературы. Секреция белков у Bacillus subtilis. Свойства секреторных белков
2.1. Введение 10
2.2. Какие белки секретируются? 12
2.3. Структура сигнального пептида в целом 13
2.4. Классификация сигнальных пептидов 15
2.4.1. Идентификация сигнальных пептидов методом компьютерного предсказания
2.4.2. Сигнальные пептиды белков, транспортирующихся по главному секреторному пути (Sec-система)
2.4.3. Сигнальные пептиды, несущие мотив с двумя аргининовыми остатками (RR-мотив)
2.4.4. Сигнальные пептиды липопротеинов 25
2.4.5. Сигнальные пептиды препилин-подобных белков 30
2.4.6. Сигнальные пептиды бактериоцинов и феромонов
2.5. Количество транспортируемых белков 34
2.6. Sec-зависимая секреторная система 39
2.6.1. Цитозольные шапероны 39
2.6.1.1. Шапероны, специфически участвующие в секреции 39
2.6.1.2. Шапероны широкого спектра действия
2.6.2. Транслоказа 44
2.6.3. Сигнальные пептидазы типа I 47
2.6.4. Процессинг липопротеинов СПазой типа II 50
2.6.5. Пептидазы сигнальных пептидов 51
2.6.6. Внецитоплазматические катализаторы фолдинга белков 52
2.6.6.1 .Петидил-пролил цис-транс изомеразы
2.6.6.2. Тиол-дисульфид оксидоредуктазы 54
2.6.6.3. Пропептиды 55
2.6.6.4. Другие катализаторы фолдинга (небелковой природы)
2.7. Контроль качества транспортируемых белков 56
2.8. Sec-независимый экспорт белков 62
2.8.1. Tat-система транспорта 62
2.8.2. Система экспорта препилин-подобных белков 64
2.8.3. ABC-система транспорта 65
2.9. Роль пропептида в секреции белков 67
2.10. Экспорт белков, локализованных в клеточной стенке 73
2.10.1. Сигналы для удержания белков в клеточной стенке 74
2.10.2. Белки, ковалентно связыванные с клеточной стенкой 74
2.11. Транспорт белков во время споруляции 75
2.11.1. Транспорт белков, специфичных для процесса споруляции 76
2.11.2. Факторы, участвующие в споруляционно-зависимом 77 транспорте белков
3. Материалы и методы 78
3.1. Материалы 78
3.2. Методы 81
3.2.1. Выделение плазмидной ДНК по модифицированному методу Бирнбойма- Долли
3.2.2. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) 81
3.2.3. Выделение фрагмента ДНК из агарозного геля методом Gene clean
3.2.4. Трансформация L-форм 82
3.2.5. Адаптация культур L-форм к росту в жидкой среде 82
3.2.6. Ферментация рекомбинантных штаммов L-форм- продуцентов GseBL и СрТ
3.2.7. Анализ экспрессии рекомбинантных генов gseBL и cpt в клетках L-форм P. mirabilis
3.2.8. SDS-электрофорез в ПААГ 83
3.2.9. Иммуноферментный анализ методом Вестерн-блоттинга
3.2.10. Анализ аминокислотных последовательностей 84
3.2.11. Определение активности глутамилэндопептидазы GseBL 84
3.2.12. Определение активности карбоксипептидазы Т 85
3.2.13. Протеолитическая активация предшественника GseBL 85
3.2.14. Выделение предшественника GseBL из культуральной жидкости L-форм
3.2.15. Выделение СрТ из культуральной жидкости L-форм P. mirabilis
3.2.16. Процессинг секреторной формы СрТ in vitro 86
3.2.17. Трансформация клеток Е. coli. Ферментация рекомбинантных штаммов Е. coli - продуцентов предшественников GseBL и СрТ в виде тел включения
3.2.18. Ренатурация предшественников протеиназ, полученных в виде тел включения
3.2.19. Трансформация клеток В. subtilis методом Спицайзена
3.2.20. Ферментация рекомбинантных штаммов В. subtilis - продуцентов GseBL и СрТ
3.2.21. Выделение геномной ДНК из клеток В. subtilis и Т. vulgaris 88
3.2.22. Разработка нового вектора pLF для экспрессии генов 88 протеиназ в В. subtilis
3223. Экспрессия генов глутамилэндопептидаз в В. subtilis на основе разработанного вектора pLF
3.2.24. Использование мини-гена, кодирующего пентапептид устойчивости к эритромицину, в качестве транскрипционного репортера в клетках В. subtilis и L-формах P. mirabilis
4. Результаты и обсуждение 96
4.1. Разработка векторных систем для клонирования в бациллах 96
4.2. Гены 8-эндотоксинов В. thuringiensis 109
4.3. Исследование генов новых секреторных ферментов бацилл 129
4.4. Изучение структуры и механизма процессинга предшественников секреторных протеиназ бацилл in vitro
4.5. Разработка промышленных продуцентов секреторных ферментов на базе бацилл с использованием генов-регуляторов секреторного аппарата
5. Выводы 186
6. Благодарности 187
7. Список литературы 188
Введение к работе
Достигнутый в последние десятилетия стремительный прогресс биотехнологии, в частности, микробиологического производства промышленных ферментов сделал бациллы одним из наиболее значимых для человека объектов живой природы, поставив их в один ряд с сельскохозяйственными животными и растениями, пекарскими дрожжами, мицелиальными грибами и актиномицетами. Иллюстрируя экономическую значимость бацилл, достаточно сказать, что объем мирового производства только препаратов а-амилазы, синтезируемых штаммами Bacillus amyloliquefaciens, в 2003 г достиг 800 тыс. тонн. Рыночная стоимость этого продукта составляет около 20 млрд. долл. Этот фермент, бесспорно, играет ключевую роль в решении проблемы разработки экономически оправданного способа синтеза топливного этанола, что в свою очередь, способно снизить зависимость экономически развитых стран от импорта нефти, решить множество глобальных социально-экономических, политических и экологических проблем. Наряду с а-амилазой, бациллы являются основными продуцентами щелочной и нейтральной протеаз, которые служат основой десятков наиболее современных технологий глубокой переработки сырья в пищевой промышленности, при синтезе моющих средств и получении новых материалов.
Уникальной особенностью бацилл с точки зрения биотехнологии является их непревзойденная способность к секреции белка во внешнюю среду в сочетании с эффективной утилизацией дешевых низкоочищенных полимерных субстратов, таких, как зерновая мука, растительная и дрожжевая биомасса в сочетании с минеральными источниками азота. Бациллы обладают мощным потенциалом аэробного метаболизма в сочетании с экзогидролазной активностью, позволяющим им стремительно расти, без потерь конвертируя субстраты в целевой продукт. Биотехнология не знает других объектов, способных в течение 30 часовой ферментации накапливать в среде до 40 г/л целевого белка.
По мере развития технологии рекомбинантных продуцентов различных белков высокая способность бацилл к секреции белка стимулировала попытки конструирования на их основе продуцентов ценных биоактивных белков и пептидов: проинсулина, интерферонов, соматотропина, сывороточного альбумина, вакцинирующих вирусных антигенов и других. Однако, все эти попытки закончились неудачно. Более того, было установлено, что бациллярные клетки неспособны к секреции даже собственных секреторных белков, подвергнутых более или менее значительным модификациям. В частности, не удалось заставить бациллы секретировать экзогидролазы, неспособные к естественному фолдингу, или лишенные ферментативной активности. Таким образом, можно сделать вывод о способности секреторного аппарата бацилл, в отличие от секреторного аппарата дрожжей, мицелиальных грибов и клеток высших эукариот, избирательно распознавать дефектные неактивные молекулы и не допускать их транспорта во внешнюю среду.
Еще одной уникальной особенностью бацилл, важной в технологическом отношении, является их способность к образованию эндоспор. С одной стороны, это делает бациллярные культуры неприхотливыми при культивировании и хранении, с другой - осложняет процесс управления ферментацией. Последнее обстоятельство обусловлено тем, что синтез секреторных ферментов бациллярными клетками жестко сопряжен со стадией, предшествующей переходу к спорообразованию. Таким образом, функционирование аппарата синтеза целевого белка в ходе ферментации бациллярного штамма-продуцента происходит в течение короткого периода, соответствующего переходу от стадии вегетативного роста культуры к формированию спор.
Цель и задачи исследования
Целью данной работы являлось изучение молекулярно-генетических особенностей бактерий рода Bacillus, обусловливающих их принципиальную с технологической точки зрения черту: способность к сверхэффективному синтезу и секреции собственных секреторных гидролаз, но не гетерологичных или дефектных гомологичных белков.
В ходе исследований решались следующие задачи:
- Разработка экспериментального метода, позволяющего направленно вносить в геном бациллярных штаммов необходимые стабильно наследуемые перестройки, инактивируя или вводя в него дополнительные копии различных генов.
- Изучение организации сопряженной со спорообразованием высокоэффективной экспрессии генов на примере параспоральных кристаллических белков Bacillus thuringiensis.
- Исследование распространенности в природных штаммах бацилл генов различных секреторных экзогидролаз, сопоставление особенностей их структуры и регуляции экспрессии.
- Разработка метода получения интактных предшественников секреторных протеаз бацилл, изучение механизма их косекреторной активации.
- Построение обобщенной модели регуляции синтеза и секреции ферментов клетками бацилл. Применение разработанной модели для получения промышленных продуцентов ферментов: нейтральных протеаз Bacillus megaterium и Bacillus amyloliquefaciens, щелочной протеазы Bacillus licheniformis и мезофильной ос-амилазы В. amyloliquefaciens.
