Введение к работе
Актуальность проблемы. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), открытый в начале 80-ых годов XX века, является этиологическим агентом синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД), неизлечимого в настоящий момент заболевания. Ежегодно в мире растет число инфицированных лиц и заболевших, эпидемия приняла всемирные масштабы. Попек хпмиопрепаратов, способных подавить или замедлить развитие ВИЧ-инфекции ведется непрерывно.
Однако главной трудностью в этом процессе является быстрое развитие устойчивости вируса к применяемым соединениям. Одним из широко используемых в настоящее время в терапии СПИДа хпмиопрепаратов является аналог природного нуклеозида тимидина - азидотимиднн (АЗТ, ретровпр, зидовудин)
- ингибитор обратной транскрипции ВИЧ. Но его применение в клинике натал
кивается на ряд ограничений, наиболее серьезными из которых являются зна
чительная токсичность и возникновение устойчивости к АЗТ, что, в конечном
счете, снижает эффективность лечения.
Ранее была выдвинута гипотеза, связывающая феномен резистентности с мутациями, возникающими в различных вирусных генах. Для ВИЧ справедливо то, что потеря чувствительности к АЗТ связана с точечными или множественными мутациями в гене рої, кодирующем обратную транскриптазу вируса: позиции 41 (Met - Leu), 67 (Asp - Asn), 70 (Lys - Arg), 215 (Thr - Phe или Туг), 219 (Lys
- Gin). Большинство вирусных вариантов, изолированных от пациентов дли
тельное время получавших ретровир обладают АЗТ-устончивым фенотипом и
слабыми репликативными свойствами.
Однако понятие "резистентность при вирусной инфекции" включает в себя не только устойчивость вируса к применяемым препаратам, но также нечувствительность клетки-мишени как к возбудителю заболевания-вирусу, так и к применяемым лекарственным препаратам. В связи с этим особую актуальность приобретают исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе феномена резистентности. Не менее важным направлением является поиск веществ, способных подавить репликацию резистентных штаммов вируса.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение механизма устойчивости трех клонов (СЕМ-К) Т-лимфрцитов к ВИЧ-1-инфекции, исследование устойчивых к АЗТ штаммов вируса, а также поиск веществ, способных подавить репликацию таких штаммов. В ходе исследования ставились следующие экспериментальные задачи:
-
исследовать клеточную модель на основе Т-клеток, нечувствительных к заражению ВИЧ-1;
-
создать коллекцию АЗТ-устойчивых цзолятов ВИЧ, полученных от пациентов длительное время получавших АЗТ-терапию;
-
изучить биологические свойства (активность репликации, цитопатоген-ность, способность к синцитийобразованию, клеточный тропизм) и чувствительность к АЗТ полученных изолятов;
4) найти комбинации препаратов, подавляющих репликацию АЗТ-
устойчнвых изолятов ВИЧ-1.
Научная новизна. В диссертационной работе, представленной к рассмотрению, описано получение уникальных Т^клеточных клонов СЕМ-К, нечувствительных к заражению ВИЧ-1. Путем трансфекщш (электропорации) полноразмерным геномом ВИЧ-1 клеток СЕМ-К получено вирусное потомство и исследован его клеточный тропизм. Изолированы АЗТ-резистентные варианты ВИЧ-1, обладающие высокой устойчивостью к азидотимидину и активными реплика-
тивными свойствами. Найдена оригинальная комбинация веществ, подавляющих репликацию АЗТ-устойчивых изолятов ВИЧ-1 в культуре клеток.
Направленность и ценность работы. Выполняя диссертационную работу, мы получили оригинальную Т-клеточную модель, нечувствительную к заражению ВИЧ-1. Установлен механизм устойчивости полученных клеточных линий к ВИЧ-инфекции. Данные линии Т-клеток могут быть успешно использованы в молекулярно-бнологических исследованиях.
Создана коллекция АЗТ-устойчивых изолятов ВИЧ-1. Изучены биологические свойства полученных природных вариантов вируса: репликативная активность, цитопатогенность, тропизм к МПК (мононуклеарам периферической крови) и различным перевиваемым Т-клеточным линиям, способность к синцн-тийобразованию. Данная коллекция может быть применена для химиотерапев-тцческих исследований ВИЧ-1, в том числе для поиска препаратов, способных подавить репликацию АЗТ-устойчивых вариантов ВИЧ-1. Исследовали возможность сочетанного влияния препаратов на репликацию ВИЧ-1. Найдена оригинальная комбинация веществ, способных подавить репликацию АЗТ-устойчивых штаммов ВИЧ-1 in vitro.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Получены уникальные клоны СЕМ-К перевиваемой Т-клеточной линии человека СЕМ, устойчивые к заражению ВИЧ-1.
-
Расшифрован механизм устойчивости клеток СЕМ-К к ВИЧ-1 - отсутствие С04-антигена - поверхностного маркера лимфоцитов человека, главного рецептора для ВИЧ.
-
Установлено, что вирус, полученный путем трансфекции (электропора-цпи) CD4- клеток СЕМ-К полноразмерным геномом ВИЧ-1, содержащимся в плазмиде HXB2D, не обладает новым фенотипом, идентичен исходному штамму ВИЧ-1 и остается тропным к CD4"*" клеткам.
-
Получено 22 АЗТ-резистентных изолята ВИЧ-1, 14 из которых являются активнореплицирующимися (rapid/high). 4 изолята проявляют высокий уровень устойчивости к АЗТ (ID50 свыше 20 мкМ).
5. Показано, что комбинация АЗТ с ингибиторами клеточного фермента
рибонуклеотидредуктазы (гндроксимочевиной или ее аналогами) подавляет ре
пликацию ВИЧ-1 в культуре клеток. Эта комбинация эффективна для АЗТ-
устойчивых вариантов вируса in vitro.
Апробация работы. Результаты работы представлены на Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 70-летию Института им. Па-стера (С-Петербург,1993), на II, III, IV международных конференциях "СПИД, рак и родственные проблемы" (С-Петербург, 1993, 1995,1996), на X международной конференции по СПИДу (Иокогама, 1994), на X Вирусологическом Конгрессе (Иерусалим, 1996), на 1-ой международной конференции, посвященной памяти М. Калоши (Будапешт,1996). В 1995 году на Всероссийском конкурсе молодых ученых-биологов в Черноголовке работа была удостоена премии.
Объем и структура работы. Диссертация построена по общепринятому плану и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов и выводов. Объем диссертационной работы составляет 165 страниц машинописного текста. Полученные результаты иллюстрированы 18 таблицами, 21 рисунком. Список литературы включает 238 наименований.