Введение к работе
Актуальность проблемы. Биосинтез ДНК является одним из ключевых процессов, протекающих в клетке. Среди подходов к изучению функционирования ферментов, синтезирующих ДНК, важное место занимает ингибиторный анализ. В настоящей работе рассмотрен синтез аналогов 2'-дезохсинуклеозид-5'-трифосфатов - субстратов ДНК-полимераз к использование этих соединений для изучения ДНК-полимераз различного происхождения. В зависимости от молекулярного механизма действия модифицированные 2'-дезоксиігуклеозид-5'-трифосфатьі можно разделить на три группы. Одну из них составляют соединения, которые, не встраиваясь в цепь ДНК, конкурируют с субстратом за связывание с ДНК-синтезирующим комплексом. Ко второй группе относятся, терминаторные субстраты, которые, конкурируя с природными 2-дезоксинуклеозид-5'-трифосфатами, включаются в цепь ДНК и прекращают дальнейшую элонгацию цепи праймера (например, из-за отсутствия в молекуле терминатерного субстрата З'-гидроксильной группы). Наконец, третья группа - соединения, которые также включаются в цепь ДНК, но не обрывают ее, а лишь замедляют дальнейшую элонгацию.
Большое значение имеет сравнительное изучение ДНК-полимераз различного происхождения, в первую очередь ферментов млекопитающих и вирусов млекопитающих. Различия в свойствах этих ферментов дают возможность избирательно блокировать репродукцию вирусного генома в клетках млекопитающих и человека. Особая актуальность этой задачи связана с распространением в последнее десятилетие вируса иммунодефицита человека (HIV), вызывающего синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД). В настоящее время все разрешеннные для лечения больных СПИД лекарственные препараты являются нуклеозидами. Действие этих веществ основано на их внутриклеточном превращении в соответствующие 5'-трифосфаты - терминаторные субстраты обратной транскриптазы HIV.
В клетках человека имеется несколько ДНК-полимераз: а, р, у, 5, е, концевая дезоксинуклеотидилтрансфераза и, возможно, некоторые другие, различающиеся по функциям и свойствам. Субстратами всех ДНК-полимераз являются 2'-дсзоксинуклеозид-5'-трифосфаты. Поэтому поиск селективных ингибиторов репродукции HIV целесообразно начинать с изучения свойств 5-трифосфатов модифицированных нуклеозидов в ДНК-
синтезирующих системах с широким набором ДНК-полимераз, включая обратную траксхриптазу HIV. Ключевым критерием при отбор.: потенциальных противовирусных препаратов на молекулярном уровне является различие их действия на ферменты млекопитающих и вируса. Эффективность в - модельной ферментной системе определяется способностью модифицированного нуклеозид-5'-трифосфата подівллть синтез ДНК, катализируемый обратной транскрилтазой HIV, а селективность - в минимальном подавлении функції:" '-обственных ДНК-полимераз клетки-хозяина. Сравнительный скрк;;ннг аналогов 2'-дезоксинуклеозкд-5'-трифосфатов в модельных системах биосинтеза ДНК позволяет сразу исключить из дальнейшего рассмотрения нуклеозущные производные, У-трифосфаты которых не являются субстратами обстой транскриптазы HTV.
На следующем уровне отбора противовирусного соединения гри исследовании в культуре клеток изучается способность модифицированного .нуклеозида фосфорилироваться в клетке, подвергаться другим внутриклеточным превращениям, влиять на общий метаболизм клетки. Следует отметить, что фосфорилирование модифицированных нуклеозидов клеточными фермеїгтами происходит значительно менее эффективно, чем природных 2'-дезоксинуклеозидов. Чтобы достичь в клетках эффективной концентрации 5'-трифосфатов модифицированных нуклеозидов, приходится создавать высокие концентрации последних. Это влияет на весь баланс нуклеозидов в клетке и приводит к нарушению нормальных метаболических процессов. Наиболее часто лимитирующей стадией в процессе превращения нуклеозида в соответствующий 5'-трифосфат является введение первого фосфатного остатка. С этой точки зрения перспективным может оказаться введение в клетку фосфорсодержащих аналогов модифицированных нуклеозидов, которые могут быть или предшественниками нуклеозидов в клетке, или подвергаться дальнейшим превращениям, имитируя природные нуюкотиды- В настоящей работе рассмотрены новые группы нуклеотидных аналогов, обладающих антиретровирусной активностью.
Цель и гздачы исследования. Настоящая работа имела целью сравнительное изучите субстратной специфичности различных ДНК-полимераз - прокариотических, зукариотических и вирусных с помощью аналогов нуклеозид-5'-трифосфатов. В ходе исследования были поставлены следующие задачи:
1. Разработка принципов конструирования и синтез нуклсозид-5'-
трифосфатов, обладающих высоким сродством к ДНК-поллмеразам из
различных іігточников.
-
Выяснение способности ДНК-полимераз катализировать синтез ДНК с модифицированными межнуклеотщшыми фрагментами, используя соответствующие трифосфатные производные. Разработка быстрого и эффективного метода получения аР-модифицированных трифосфатных аналогов.
-
Разработка принципов создания и синтез нуклеотндных производных -эффективных блокаторов репродукции вируса иммунодефицита человека в клеточных культурах.
-
Разработка метода получения индивидуальных стсреоизомеров. модифицированных нуклеозид-5'-трифосфатов и их использование как инструментов для изучения стереоселективности различных ДНК-полимераз.
Предполагалось, что в результате работы будут найдены соединения, обладающие высокой антиретровирусной активностью. Научная новизна работы
Выдвинуто и экспериментально подтверждено предположение о высоком сродстве к ДНК-полимеразам нуклеозид-5'-трифосфатов с уплощенной конформацией углеводного фрагмента молекулы. Для этого разработаны методы синтеза и получены 5'-трифосфорилированные нуклеозиды, содержащие г'.З'-двойную связь, а также 2',У-ликсо-'и 2\"3'-рибоэпокси группы. Описан эффективный способ получения У-тркфосфатов из соответствующих модифицированных нуклеозидов. Выявлена низкая специфичность обратных транскриптаз ретровирусов к субстратам с уплощенным углеводным фрагментом.
Продемонстрирована способность ряда ДНК-полимераз использовать в качестве субстратов аР-алкилированные нуклеозид-У-трифосфаты и катализировать образование цепей ДНК с незаряженными межнуклеотидными звеньями. Предложен способ получения <хР-модифицированных dNTP без выделения промежуточных продуктов. Показана высокая селективность ДНК-полимераз по отношению к стереоизомерам осР-арилированных трифосфатных аналогов. На примере аР-алкилированных и арилированных dNTP продемонстрирована низкая специфичность обратных транскриптаз к модификациям а-фосфатных остатков. V '
С учетом этого свойства предложено использовать с качестве блокатора репродукции HIV 5'-монофосфаты нуклеозидов, кодифицированные по атому фосфора. На основании предложенных ранее и найденных нами подходов осуществлен синтез новых групп соединений - фосфонатов и фторфосфатов нуклеозидов, модифицированных по углеводному остатку, многие из которых оказались высокоэффективными ингибиторами репродукции HIV в клеточных культурах. "'>
Разработан метод стереохонтролируемого синтеза всех четырех изомеров карбоцнклического аналога 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидро-5,-норадено-зина, исходя из одного ключевого соединения. Полученные трифосфатньте производные с траяс-расположением адешша и трлфосфатного - остатка оказались селективными ингибиторами концевой дезоксинухлеотидил-трансферазы. Таким образом, впервые найдены высокоселективные ингибиторы этого фермента.
Практическая ценность. Найдены нуклеозидные производные,
эффективно ингибирующие репродукцию вируса иммунодефицита
человека в культуре клеток. Одно из наиболее актизных соединений - 5'-z
Н-фосфонат З'-азидо^З'-дидезоксіггамидина ("Фосфазид") в настоящее
время успешно прошло доклинические испытания по правилам
Фармакологического Комитета РФ в Кардиологическом Научном Центре
РАМН. Разработаны препаративные методы получения потенциальных
противовир>сных препаратов: - - - -
Апробация работы. Диссертационная работа была апробирована на заседании межлабораторного научного семинара Института Молекулярной Биологии им.ВА.Энгельгардта РАН в феврале 1995 г.
Основные результаты работы докладывались на конкурсе научных работ ЙМБ РАН в 1989, 1991, 1993 годах, а также на международных симпозиумах "Проблемы иммунофармакологии" (Тбилиси, 1990 г.), "Синтетические олигонуклеотиды: проблемы и границы практического применения" (Москва, 1991 г.), 7-ом и 9-ом Симпозігумах по химии компонентов нуклеиновых кислот (Чехия, 1987г. и 1993 г.), 2-ом Международном симпозиуме по фосфорной химии, ориентированной на биологию (Лодзь, 1986 г.), VIII Средиземноморском конгрессе по химиотерапии (Афины, 1993 г.), VIII Международном конгрессе по вирусолопш (Берлин, 1990 г.), на 9-ом, 10-ом и 11-ом Международных круглых столах " Нуклеозиды, нуклеотиды и их биологическое применение" (Уппсала, 1990 г.; Парк-Сити, 1992 г.; Лувен, 1994 г.).
Структура работы. Диссертация изложена в настоящей работе в віще научного доклада. Основная часть результатов получена в соавторстве с АА-Арзумановым, Л.СВикторовой, М.К.Кухановой, Д.Г.Ссмизаровым, АМАтраэкевым, З.Г.Чиджавадзе, Р.Ш.Бибилашвили, М. фон Янта-Л^пішіским. Вклад других соавторов отражен в публикациях по теме диссертации. Всем коллегам приношу глубокую благодарность за участие в совместных работах. Искренне признательна А_АКраевскому за постоянный интерес, помощь, поддержку и обсуждение работы.