Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 8
1. Общее описание болезни 8
1.1 Первый случай. История развития исследований 8
1.2 Клиническая картина 10
1.3 Патологические изменения мозга 11
1.4 Эпидемиология 12
1.5 Генетика 13
1.5.1 АРР - предшественник амилоида 13
1.5.2 Пресенилин 1 ипресенилин2 14
1.5.3 Аполипопротеин Е 14
1.5.4 Тау 16
2 Результаты и их обсуждение 18
1. Клонирование и картирование гена АРР 18
2. Внутриклеточные процессы 21
2.1 Экспрессия и гиперэкспрессия АРР 21
2.2 Регуляция экспрессии АРР 24
2.3 Процессирование АРР 27
2.4 Локализация пресенилина и его роль в адгезии клеток 32
2.5 АРР и убиквитин-протеосомная система деградации белков 36
2.6 Митотический нуклеолин в НФК 41
2.6.1 Антигеном TG-3 является митотический нуклеолин 42
2.6.2 Фосфорилирование нуклеолина киназой p34Cdc2 создаёт зпитопТв-З 44
2.6.3 Временные и пространственные изменения нуклеолина в митозе 46
2.6.4 Два вида нуклеолина в митотических клетках 48
2.6.5 Распределение нуклеолина в мозге при болезни Альцгеймера 49
2.6.6 Присутствие митотического нуклеолина в НФК 52
3. Внеклеточные процессы 54
3.1 Взаимодействие Ар пептида и апоЕ 54
3.1.1 Аполипопротеин Е є4 является фактором риска Б А 55
3.1.2 апо ЕЗ и апо Е4 по-разному взаимодействуют с А5 пептидом 57
3.1.3 Зависимость количества амилоида от изоформы апоЕ 59
3.2 Секвестрирование А5 пептида 60
3.2.1 Транстиретин-основной секвестрирующий белок 62
3.2.2. Влияние НСПВЛ на уровень ТТР 65
3.2.3. Влияние интерлейкинов 1 и 6 на уровень ТТР 66
4. Природа генетических форм прионовых заболеваний 67
4.1 Сходство между болезнью Альцгеймера и прионовыми заболеваниями 67
4.2 Заболевание Кройцфельдта-Якоба и мутации в гене PRNP 69
4.3 Болезнь Герстмана-Стройслера-Шейнкера и мутация в гене PRNP 70
Заключение 72
Выводы 74
Список литературы 75
Благодарности 89
Введение к работе
Болезнь Альцгеймера является основной причиной слабоумия у пожилых людей и проявляется как прогрессирующая нейродегенерация мозга. Основными патологическими изменениями при этой болезни являются межклеточные отложения амилоида в мозгу и внутринейронные накопления фибриллярных клубков, преимущественно в коре головного мозга и гиппокампе. Постепенная и прогрессирующая потеря памяти и главных функций интеллекта у больных обычно начинает проявляться примерно с 65 лет. Болезнь прогрессирует в течение многих лет и в итоге приводит к прекращению основных функций мозга и полному распаду личности. Лечения в настоящее время нет и болезнь неизбежно кончается смертью. В редких случаях болезнь возникает в более раннем возрасте и иногда носит семейный характер. Однако, около 85% случаев являются спорадическими и представляют собой так называемую позднюю форму болезни. Начиная с 65 лет количество случаев удваивается каждые пять лет, и около 50% людей, доживших до 85-90 лет, заболевают болезнью Альцгеймера. С увеличением продолжительности жизни в экономически развитых странах количество больных возрастает экспоненциально и уже исчисляется миллионами. Стоимость ухода за больными, с учетом потерянного рабочего времени членов семьи, исчисляется в сотнях миллиардов долларов. Болезнь Альцгеймера представляет собой не только личную трагедию семьи, но уже начинает превращаться в общенациональный кризис во всех экономически развитых странах мира. С улучшением уровня жизни в странах с активно развивающейся экономикой продолжительность жизни населения увеличивается и с ней увеличивается количество больных болезнью Альцгеймера. Таким образом, болезнь Альцгеймера переступила границы экономически развитых стран и становится глобальной медицинской проблемой человечества XXI века.
Хотя болезнь была впервые описана в 1906 году, причины заболевания были неизвестны и долгое время подозревалось, что старческое слабоумие является результатом естественного старения организма. Только в середине 60-х годов было показано, что амилоидные отложения и внутринейронные фибриллярные сгустки являются характерными изменениями мозга, присущими
именно больным болезнью Альцгеймера. Однако, ответов на вопросы о причинах и природе заболевания и о процессах, ведущих к характерной патологии мозга, не было, как не было и ответа на вопрос почему у больных синдромом Дауна, явно генетической детской болезнью, к 30-40 годам развиваются характерные патологические изменения мозга, идентичные изменениям, наблюдаемым у больных болезнью Альцгеймера.
Целями данной работы являлось выяснение причин, вызывающих болезнь Альцгеймера, и изучение молекулярных процессов, ведущих к характерным патологическим изменениям мозга больных.
Все научные результаты полученные в работе являются оригинальными. В частности, был клонирован ген АРР, кодирующий 4 кДа Ар пептид, основной компонент амилоидных отложений. Обнаружено, что Ар пептид является фрагментом большого белка АРР - предшественника амилоида (amyloid precursor protein). Ген АРР был картирован на хромосоме 21. Таким образом, была объяснена причина идентичности характерных патологических изменений в мозгу больных с синдромом Дауна и больных болезнью Альцгеймера. Предсказано, что перепроизводство Ар пептида является основой патологии болезни Альцгеймера. Показано, что в мозгу экспрессия гена АРР носит сложный региональный характер. Обнаружено, что по сравнению с контролем, у больных уровень мРНК АРР в мозгу повышен. Показано, что у гена АРР сложная траскрипционная структура и синтезируются три изоформы белка, АРР695, АРР751 и АРР770. Идентифицированы ключевые элементы промотора АРР, отвечающие за базовую и модулируемую активность гена.
Показано, что белок АРР подвергается протеолитическому расщеплению. Показано, что пресенилин, участвующий в процессировании АРР, находится на поверхности клеток и участвует в межклеточной адгезии.
Обнаружено, что АРР деградируется убиквитин-протеосомной системой и что АР пептид блокирует деградацию белков, связываясь с внутренними активными центрами протеосом.
Показано, что Ар пептид взаимодействует с АРР и с аполипопротеином Е (апоЕ), причем взаимодействие с изоформами апоЕ4 и апоЕЗ различны.
Исследована корреляция между изоформами ароЕ и болезнью
Альцгеймера и показана ассоциация аллели апоЕ4 с поздней превалирующей формой болезни. Показано, что наличие аллели апоЕ4 ассоциировано с увеличением количества амилоида в мозгу больных.
Постулирована гипотеза секвестрирования А(3 пептида и найден главный секвестрирующий белок - преальбумин (transthyretin - ТТР). Показано, что ТТР предотвращает образование амилоида. Определена ключевая аминокислота ТТР, ответственная за взаимодействие ТТР с Ар пептидом. Показано, что нестероидные противовоспалительные лекарства, которые способствуют предотвращению болезни Альцгеймера, повышают уровень ТТР.
Исследования внутринейронных нейрофибриллярных клубков (НФК) привело к открытию особой митотической формы фосфолирированного нуклеолина в цитоплазме нейронов гипокампа больных болезнью Альцгеймера. Идентифицирован уникальный эпитоп этой формы нуклеолина и показано, что стерически он идентичен эпитопу белка тау, главного компонента НФК.
В дополнение, открыта первая мутация в сходном с болезнью Альцгеймера нейродегенеративном заболевании - болезни Кройцфельдта-Якоба и, таким образом, доказана генетическая основа этой болезни. Кроме того, открыта первая мутация, вызывающая другое также сходное с болезнью Альцгеймера заболевание, синдром Герстманна-Страуслера-Шейнкера. Обе мутации обнаружены в гене приона ПРНП (предшественника нормального приона). Дополнительные мутации этого гена, приводящие к изменению числа повторов в белке приона, также были открыты в случае болезни Кройцфельдта-Якоба.
Клиническая картина
Современная диагностика БА основана на выявлении деменциии, проявляемой как прогрессивная потеря памяти, ухудшающиеся способности больного выполнять обычные ежедневные активности, психические нарушения, изменения личности, потеря ориентации и проблемы с поведением. Хотя клиническая картина варьирует, диагностические характеристики деменции достаточно устойчивы. Критерии, описанные в последнем 4-ом издании Диагностического и Статистического Руководства Психиатрических Заболеваний {Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th ed. DSM IV), включают множественные когнитивные дефециты в дополнение к нарушениям памяти. На ранних стадиях болезни нарушения памяти могут быть единственными клиническими проявлениями и сами по себе являются недостаточными для полного диагноза деменции. Для того,чтобы соответствовать критериям DSM-IV, когнитивные нарушения должны достигнуть такой степени, чтобы социальные и профессиональные функции больного стали ниже его нормальных способностей. В большинстве случаях болезнь прогрессирует медленно в течение 4-20 лет постепенно приводя больного в тяжёлое состояние с серьёзными нарушениями поведения, сильными затруднениями в речи, недержанием мочи и полной социальной зависимости.
В последних стадиях болезни часто наблюдается полное отсутствие аппетита и многие больные умирают от голода. Болезнь неизбежно кончается смертью. При вскрытии обычно наблюдают атрофию коры головного мозга и классические гистологические поражения в гипокампе, энторальном кортексе, амигдале и в некоторых подкорковых зонах, проектирующих в эти пораженные районы мозга. Во многих нейронах находятся патологические структуры, напоминающие спутанные волокна, так называемые нейрофибриллярные клубки (НФК). Эти клубки представляют собой спирально скрученные филаменты, состоящие в основном из гиперфосфорилированного белка тау. Амилоидные бляшки представляют собой внеклеточные компактные сферические отложения, состоящие из 8 нм фибрилл Ар пептида, которые часто окружены дистрофическими дендритами и аксонами. Поражения такового вида называют нейритными бляшками. Однако, при типичной БА, только часть всех амилоидных отложений Ар пептида имеют такую морфологию. Гораздо больше бляшек, которые которые имеют аморфную, штриховую или грубо сферическую форму. Такие отложения амилоида, называемые диффузными бляшками, содержат АР пептиды в различных стадиях аггрегации и количество 8 нм амилоидных фибрилл в них незначительно. Предполагается, что диффузные бляшки постепенно переходят в нейритные. Электронномикроскопический анализ показал, что большинство диффузных бляшек содержат очень мало дистрофичных нейритов. Похоже, локальное накопление не фибриллярных форм Ар пептида не вызывает сколь либо значимого изменения нейропила.
В дополнение к амилоидным бляшкам различной морфологии, амилоидные отложения находят в менингиальных кровеносных микрососудах, содержащих фибриллярный АР пептид в базальной мембране. В некоторых случаях такой васкулярный амилоидоз принимает особо тяжёлые формы. Хотя сущуствуют значительные вариации в количестве и качестве бляшек и НФК у разных больных БА, нейропатология болезни сравнительно стандартна. Существование чётко определённой и относительно специфической патологии явилось важной причиной того, что значительный прогресс был достигнут в понимании патогенеза БА в течении последних двух десятилетий. Информация о сложных клеточных и молекулярных изменений в процессе развития болезни постепенно возникала из всё более детального анализа композиционного содержания двух основнных патологических поражений мозга больных Б А - амилоидных отложений и НФК. В настоящее время БА поражает более 4 миллионов только в США (население 250 миллионов) и с подбной же частотой встречается в других развитых и развивающихся странах. Расходы, связанные с БА, только в США достигают 85 милиардов долларов в год. БА является самой распространённой причиной деменции. Около 50% всех случаев деменции пожилых людей вызываются Б А. Около 1% 60-летних болеет Б А. Количество больных удваивается каждые 5 лет и к 90 годам около 50% людей заболевают БА (Hebert et al. 1995). Факторами риска являются возраст, наличие случаев БА среди кровных родственников, головные травмы, низкий образовательный уровень и женский пол. Быстро изменяющаяся демографическая ситуация в мире, приводящая к увеличению продолжительности жизни, означает что количество больных БА будет расти. Так, число американцев старше 65 лет почти удвоилось с 16,6 миллионов в 1960 году до 31 миллиона в 1990 году.
Ожидается, что быстро растущее число пожилых и старых людей в США удвоится к 2030 году. Почти 79 миллионов американцев будут старше 65 лет к 2050 году и частота заболеваемости Б А к тому времени достигнет 14 миллионов в год. Распространение БА в других странах с развитой экономикой сходно с распространением в США, а в Голландии БА официально объявлена болезнью угрожающей нации. Эти данные свидетельствуют о том, что Б А является чрезвычайно серьёзной социальной и экономической медицинской проблемой стран с развитой и быстро развивающейся экономикой, в которых явно прослеживается тенденция к увеличению продолжительности жизни. БА условно разделяют на две группы - с ранним и с поздним началом заболевания, принимая 65 лет как точку разделения. Заболевания с ранним началом (ранняя форма - РФБА) обычно являются семейными, тогда как заболевания с поздним началом болезни (поздняя форма - ПФБА) обычно являются спорадическими. Подавляющее число случаев БА представлены поздней формой. Долгое время считалось, что генетика не играет никакой роли в БА. Однако, клонирование гена АРР в 1986 году автором этой диссертационной работы совместно с его коллегами, заложило основу современного генетического подхода к БА. Приблизительно 1-5% всех случаев Б А являются чисто генетическими с автосомно доминантной формой передачи болезни по наследству (St.George
Внутриклеточные процессы
Размер мРНК АРР, кодирущей три изоформы белка, определённый методом Норзерн-гибридизации, равнялся 3,2-2,4 килобаз. Анализ мРНК гена АРР показал, что ген экспрессирован во всех главных органах, включая мозг, однако уровень экспрессии зависел от ткани и в печени был еле заметен. Нейроанатомический анализ распределения мРНК в клетках мозга был проведен методом гибридизации in situ используя РНК-зонды, меченные либо радиоактивной серой 35S , либо биотином. Были исследованы районы коры головного мозга и гиппокампа, которые больше всего поражаются болезнью Альцгеймера, и мозжечок, который обычно не поражается (Рис. 2). Для сравнения использовали мозговые ткани больных болезнью Альцгеймера, контролей без деменции (Рис. 2-1, 2-2, 2-4) и обезьян Масаса fascicularis (Рис. 2 3). Биотинилированные зонды использовались для более тонкой дифференциации морфологии клеток мозга и для полуколичественного определения мРНК АРР (Рис. 2-1, 2-2). Радиоактивные зонды были использованы для регистрации мРНК в различных слоях и зонах мозга и для сравнительного определения количества мРНК АРР (Рис. 2-3, 2-4). Было обнаружено, что АРР экспрессирован во многих, но не во всех клетка мозга. В основном мРНК АРР была определена в нейронах.. Интересно, что в гиппокампе и кортексе, т.е. в районах мозга, которые сильнее всего поражаются болезнью Альцгеймера, уровень мРНК АРР был высокий (Рис. 2-2, 2-3, 2-4). Положительные сигналы были также зарегистрированы в клетках микроглии, эндотелиальных клетках кровеносных сосудов мозга и в перицитах. Значительное количество мРНК АРР часто обнаруживали в больших пирамидальных нейронах с нейрофибриллярными клубками. Экспрессия АРР носила региональный характер. Качественной разницы в распределении мРНК АРР в мозге больных болезнью
Альцгеймера и контрольных больных без деменции не было, как не было и разницы в экспрессии АРР в мозгу человека и обезьян. Однако, количество мРНК АРР в различных районах и слоях мозга сильно варьировало. Высокий уровень был обнаружен в гиппокампе и в базальном ядре Мейнерта, в визуальном, фронтальном и префронтальном кортексах. С другой стороны, в большинстве клеток мозжечка, стволового мозга и спинного мозга уровень экспрессии гена АРР был низок. Внутри каждого исследованного района мозга уровень мРНК АРР также варьировал. Так, в гипокампе высокий сигнал был обнаружен в полях СА1 и САЗ, тогда как количество мРНК АРР было низким в соседних районах, таких как субикулум, парасубикулум и в энторальном кортексе. Наиболее интересная разница в количестве мРНК АРР была обнаружена при сравнении и анализе радиоактивных сигналов секций мозга больных болезнью Альцгеймера и соответствующих контролей без деменции. У контролей количество мРНК АРР в нейронах dentate gyrus и полей cornu Ammonis было в 2.5 раза больше, чем в нейронах субикулума и энторального кортекса (Рис. 2-4). У больных количество мРНК АРР в этих районах было одинаково. В районах гиппокампа разница была настолько значительна, что она была явно заметна даже при использовании биотинилированных зондов, которые обычно применяются для качественного анализа результатов гибридизации (Рис. 2-2). Таким образом, нами было обнаружено, что при болезни Альцгеймера в определённых субпопуляциях нейронов регуляция гена АРР изменена и приводит к его гиперэкспрессии. Материалы и методы использовавшиеся для получения представленных результатов были подробно описаны в работах автора (Bahmanyar et al., 1987; Higgins et al., 1987; Lewis et al., 1987; Schmechel et al., 1988; Goldgaber abd Schmechel, 1989; 1990). Первые анализы экспрессии гена АРР в культурах клеток показали, что количество определяемой мРНК АРР зависит от ряда факторов. В частности, уровень мРНК резко падал в клетках образовавших монослой, позволяя предположить, что контактное торможение может играть значительную роль в регуляции экспрессии гена АРР. Мы обнаружели, что целый ряд биологически активных модуляторов влияют на экспрессию гена АРР. Пожалуй наиболее интересным было открытие гиперэкспрессии АРР в результате стимулирования транскрипции гена АРР интерлейкином 1 (ИЛ-1). Важность этого наблюдения была связана с тем, что количество ИЛ-1 в мозгу больных болезнью Альцгеймера значительно повышено. Так как ИЛ-1 является характерным показателем воспаления, можно предположить, что процессы, подобные воспалительным, играют важную роль в патологии болезни Альцгеймера. Однако, связь ИЛ-1 с патологическими процессами болезни Альцгеймера была не ясна. Анализ последовательности промотора гена АРР (Salbaum et al., 1988) показал, что в промоторе есть два элемента АР-1, которые могут объяснить стимуляцию экспрессии гена АРР ИЛ-1. Для картирования элемента, действительно ответственного за влияние ИЛ-1, различные фрагменты промотора были соединены с геном-репортёром, кодирующим человеческий ростовой гормон (ЧГР). Клетки мышиной нейробластомы АВ-1 были трансфецированы рекомбинантными плазмидами, содержащими различные фрагменты промотора. Количество ЧГР, секретированного в среду, было определено радиоиммуным методом.
Анализ результатов показал, что участок промотора АРР, отвечающего на стимуляцию ИЛ-1, находится между нуклеотидами -485 и -305. В этой зоне промотора находится только один элемент АР-1, который, по-видимому, и является элементом ответственным за стимуляцию уровня транскрипции гена АРР ИЛ-1 (Рис. ЗА, В). Для определения элементов, ответственных за базовую экспрессию гена АРР, был проведен анализ последовательных делеций его промотора. Различные делеционные фрагменты промотора были помещены в 5 -положении к репортёру, гену хлорамфеникол ацетилтрансферазы (CAT), и полученные плазмиды были трансфецированы в различные культуры клеток. Измерение транзиентной ферментативной активности CAT позволило оценить активность промотора количественно. Оказалось, что для базовой экспрессии АРР необходим участок промотора длиной в 94 оснований от старта транскрипции. Анализ делеций проксимального района промотора АРР показал наличие двух элементов, АРВа (от -55 до -31) и АРВр (от -93 до -82), отвечающих за базовую экспрессию гена (Рис. ЗС). Два ядерных фактора, связывающихся с этими элементами, были охарактеризованы методами сдвига в электрофорезе, ДНКазным футпринтингом и интерференцией метилирования. Исследования ядерных экстрактов показали, что с элементом АРВа связывается гетеромер, состоящий из двух термостабильных транскрипционных факторов - белков USF43 и USF44, которые являются членами семейства белков bHLH (basic helix-loop-helix). Однако, для высокого уровня экспрессии АРР в клетках HeLa и PC-12 абсолютно необходимым является элемент АРВ(5, который отвечает примерно за 70% базовой активности промотора. Последующие эксперименты показали, что хорошо известный траскрипционный фактор CTCF, содержащий 11 цинковых пальцев, связывается с АРВр элементом (Vostrov et al., 1997). Таким образом, нами были определены два основных базовых элемента и первый модулирующий элемент промотора, ответственного за гиперэкспрессию АРР. Материалы и методы использовавшиеся для получения представленных результатов были подробно описаны в работах автора (Goldgaber et al., 1989; Quitschke and Goldgaber, 1992; 1995; Vostrov et al., 1995).
Митотический нуклеолин в НФК
Целый ряд сообщений указывает на реактивацию клеточного цикла впостмитотических нейронах в мозгу больных БА. Высказывалисьпредположения, что такая патологическая реактивация может служить основной причиной нейрофибриллярной дегенерации типичной для Б A (Busser et al., 1998; Liu et al., 1995; McShea et al., 1997 ; Nagy et al.,. 1997; Vincent et al., 1995; Vincent et al., 1997). Было показано, что киназа p34Cdc2 активирована в нейронах мозга больных Б A (Vincent et al., 1997). Более того, используя иммунолокализацию, другие маркеры клеточного цикла тоже были найдены в нейронах мозга больных БА (Busser et al., 1998; McShea et al., 1997 ; Nagy et al.,. 1997). Аберации в активации митотических механизмов в постмитотических нейронах может начать серию клеточных событий приводящую к образованию НФК и нейродегенерации. Свидетельством того, что митотические механизмы вовлечены в образование НФК были получен тогда, когда моноклональныеантитела генерированные против иммунноочищенных препаратов НФК, оказались специфично не только при анализе срезов мозга больных БА, но и узнавали с высокой специфичностью иключительно митотические клетки в культурах (Vincent et al., 1996). В этой же работе было показано, что моноклональные антитела МРМ-2, генерированные против митотических клеток, специфично прокрашивали срезы мозга больных БА, но не реагировали со срезами мозга контролей. Более того, МРМ-2 узнавали НФК, нейритные компоненты амилоидных бляшек и морфологическинормальные нейроны, предполагая, что детектируется маркер ранних этапов дегенерации. Из всех моноклональных антител, описанных Винсент с коллегами, моноклональные антитела TG-3 были наиболее специфичны для нейрофибриллярной патологии БА при полной отсутствии сигнала в мозговых срезах контролей. Поэтому, идентификация антигена, узнаваемого этими антителами является абсолютно необходимым для понимания конвергенции нейрофибриллярной дегенерации и митоза. Первый иммунореактивный белок в мозгу больных БА, узнаваемый антителами TG-3, оказался гиперфосфолированный тау (Jicha et al., 1997). Однако другие TG-3 антигены определены не были. В культурах клеток, не экспрессирующих белок тау, антитела TG-3 детектировали белок размером в 105 кДа, который значительно больше тау (Vincent et al., 1996). Поэтому мы поставили задачу идентифицировать и характеризовать митотический клеточный белок, узнаваемый антителами TG-3.
Антиген TG-3 узнавал 105 кДа бэнд в экстрактах клеток линии НЕр2, которые были синхронизированы в митотической фазе обработкой нокодазолом (Рис 9В, дорожка 5). Этот бэнд также обнаруживался в экстрактах синхронизированных клеток MSN нейробластомы (Vincent et al., 1996) и клеток HeLa (данные не представлены). Появление этого бэнда не является артефактом обработки нокодазолом, так как, такой же бэнд был найден в экстрактах митозных клеток линии НЕр2, стряхнутых с матрасов (Рис. 9В, дорожка 3). Антиген TG-3 был очищен из синхронизированных нокодазолом клеток линииНЕр2 на хромотографической колонке и секвенирован, начиная с N-конца (Рис. 9А). Последовательность первых 18 аминокислот антигена TG-3 идентична N-концевой последовательности человеческого нуклеолина, белка с массой 105 Для того, чтобы исключить возможность того, что минорный белок того же размера, очищенный вместе нуклеолином, может включаться в иммунореактивность антигена TG-3, мы иммунопреципитировали лизаты клеток с моноклональными антителами MS3 к нуклеолину и анализировали иммунопреципитат с помощью TG-3. Был обнаружен бэнд массой 105 кДа, преципитировавший с антителами MS3 и выявлявшийся антителами к антигену TG-3 (Рис. 9В, дорожка 7). Эти результаты подтверждают нашу первоначальную гипотезу о том, что и антитела MS3 и антитела к антигену TG-3 узнают нуклеолин в митотических клетках.
Для дальнейшего подтверждения этой гипотезы очищенный белок, выделенный из синхронизированных нокодазолом клеток, был подвергнут химической деградации с либо N-хлоросукцинимидом, либо с гидроксиламином (Рис. 10). Каждый из этих реагентов химически расщепляет нуклеолин в двух местах, уникальных для каждого реагента. После расщепления образуются 3 фрагмента, два из которых узнаются антитела MS3 и антитела TG-3. Было обнаружено, что узнаваемые бэнды переходят в область 92 и 74 кДа после обработки N-хлоросукцинимидом (Рис. 10А) и гидроксиламином (Рис. 10В) соответственно. Необходимо отметить, что хотя нуклеолин содержит только 2сайта для каждого реагента, в наших экспериментальных условиях мы обнаружили продукты только одного акта расщепления. После каждой реакции деградации и антитела MS3 и антитела к TG-3 связывались с одинаковыми бэндами, позволяя предположить, что они связываются с одним и тем же фрагментом белка. Таким образом, принимая во внимание и результаты экспериментов по химической деградации, и результаты иммунопреципитации, можно сделать вывод о том, что антитела TG-3 действительно узнают нуклеолин в митотических клетках.мембрана была анализирована антителами TG-3 (дорожки 1, 2), тестирована ECL, антитела были убраны и мембраны были анализированы с помощью антителами MS3 (дорожки 3, 4). Контрольные пробы не содержали лизирующего соединения (дорожки 1,3).
Нуклеолин является одним из важнейших клеточных белков, содержащем в своем составе, по-видимому, 9 сайтов фосфорилирования для одной из основных киназ Cdc2. С(іс2-опосредованное фосфорилирование показано для нуклеолина как в экспериментах in vitro, так и in vivo (Belenguer et al., 1990) Предшествующие исследования продемонстрировали, что антитела TG-3 узнают фосфоэпитопы этого белка (Vincent et al., 1996; Jicha et al., 1997)
Так как антитела TG-3 узнают нуклеолин в митотических и не интерфазных клетках, следующие эксперименты были поставлены для того, чтобы проверить, является ли иммунореактивность TG-3 результатом фосфорилирования нуклеолина киназой cdc2. Интерфазный нуклеолин, не
Секвестрирование А5 пептида
Происхождение амилоида, явно патологического образования в мозговой ткани больных, являлось одним из центральных вопросов, стоявших перед исследователями болезни Альцгеймера. До клонирования гена АРР не было даже ясно, является ли амилоид продуктом человеческого генома. Клонирование гена АРР и его картирование его на хромосоме 21 ответило на этот фундаментальный вопрос. Однако, считая амилоид результатом патологического процесса, большинство исследователей также рассматривали и основной компонент амилоида, Ар пептид как продукт патологического процесса. Эта точка зрения была подкреплена обнаружением протеолитического расщепления АРР в альфа сайте, который находится внутри района АР пептида. Казалось, что нормальный процессинг АРР предотвращает появление полноценных молекул Ар пептида. Поэтому был сделан вывод, что генерация АР пептида должна происходить только патологическим путём. Однако два года спустя АР пептид был обнаружен в плазме и СМЖ не только больных болезнью Альцгеймера, но и здоровых людей (Seubert et al., 1992). Более того, оказалось, что любые клетки, которые синтезируют АРР, секретируют Ар пептид. Таким образом, стало ясно что Ар пептид появляется в результате нормального процессирования АРР и был найден Р сайт расщепления АРР. С другой стороны, уже было известно, что АР пептид токсичен для клеток и спонтанно образует амилоид. Так как у здоровых людей амилоида нет, эти наблюдения означали, что здоровый организм защищен от токсичности Ар пептида и что существует механизм, предотвращающий образование амилоида. Для того, чтобы объяснить эти процессы защиты, мы предложили гипотезу секвестрирования Ар пептида. Мы постулировали, что в норме Ар пептид всегда находится в комлексе с другими молекулами. Находящийся в комплексе АР пептид не токсичен и не способен образовывать амилоид.
Образование комплекса является механизмом регуляции билогической активности АР пептида и необходимым шагом его метаболизма, приводящего к выводу Ар пептида из организма. При болезни Альцгеймера механизм секвестрирования АР пептида нарушается, что и приводит к образованию амилоида и смерти клеток чувствительных к АР пептиду. (Goldgaber et al., 1993). Для того, чтобы идентифицировать молекулы, которые взаимодействуют и образуют комплексы с Ар пептидом, мы инкубировали образцы СМЖ, полученные от больных без деменции, с синтетическим А(540 пептидом, меченным радиоактивным иодом I с помощью реагента Болтона-Хантера. После инкубации проводили анализ с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН (Рис. 17-1). До инкубации радиоиодированный АР пептид агрегировал в физиологических растворах. Однако, после инкубации с СМЖ агрегации не было. Вместо этого электрофоретическое разделение позволило выявить два вида комплексов, имеющих электрофоретическую подвижность, соответствующую 30 кДа и 50 кДа. Эти комплексы отличались от 40 кДа комплексов апоЕ-Ар пептид, которые мы описали в предыдущей главе. Белки, образующие эти комплексы, были очищены, переварены трипсином и несколько образовавшихся пептидов были подвергнуты секвенированию. Анализ полученных последовательностей показал, что белок, образующий 30 кДа комплекс, являлся транстиретином (transthyretin — TTR). Белок, образующий 50 кДа комплекс, оказался альбумином. При инкубации с немеченным АР пептидом коммерческие препараты ТТР образовывали комплексы 30 кДа. Однако, коммерческие препараты альбумина не образовывали комплексов с немеченым Ар пептидом. При инкубации немеченного АР пептида с образцами СМЖ образовывались только 30 кДа комплексы. По-видимому, появление 50 кДа комплексов было связано со взаимодействием альбумина с модифицированным иодированием Ар пептидом. Флуорометрия в присутствии тиофлавина Т была использована для количественной оценки влияния ТТР на агрегацию Ар пептида. Результаты проведённых экспериментов убедительно показали, что ТТР снижает флуоресцентный сигнал, связанный с агрегацией Ар пептида (Рис. 17-2). Снижение сигнала было пропорционально количеству ТТР. В отличие от ТТР, присутствие альбумина не влияло на агрегацию Ар пептида. Агрегаты Ар пептида прокрашивали Конго Красным, который обычно используется для прокрашивания амилоида. При таком окрашивании амилоида образуется характерное жёлто-зелёное свечение в поляризованном свете. Добавление альбумина к препаратам Ар пептида не уменьшало это характерное свечение. Однако, добавление ТТР резко снижало количество агрегатов Ар пептида с характерным свечением. Другим характерным признаком амилоида является образование характерных фибриллярных структур, легко узнаваемых при электронной микроскопии.
Синтетический Ар пептид легко образует эти типичные амилоидные фибриллы толщиной в 5 и 10 нм. Однако, после инкубации АР пептида с ТТР мы наблюдали только аморфные массы с несколькими короткими фибриллами (Рис. 17-3). Таким образом, наши эксперименты убедительно показали, что ТТР является белком, секвестрирующим Ар пептид и предотвращающим образование амилоида. Для того, чтобы понять взаимодействие Ар пептида и ТТР мы построили модель комплекса. Модель комплекса позволила предсказать, что положительно заряженный район Ар пептида, содержащий аминокислоты Arg (5), His (13), Lys (16) и Lys (28), очень хорошо комплексуется с отрицательно заряженной поверхностью ТТР, содержащей аминокислоты Asp (38), Glu (42), Glu (62) и Glu (66). Последующий анализ делеционных и точечных мутантов ТТР показал, что глютамин 42 является критически важным для образования комплексов. Обнаружение секвестрирования Ар пептида и выявление ТТР как главного секвестрирующего белка в СМЖ, открыло новые перспективы в исследовании болезни Альцгеймера. Исследования образцов СМЖ в шести различных лабораториях мира показало, что у больных болезнью Альцгеймера уровень ТТР снижен. Комплексы Ар пептида с ТТР были обнаружены в почках. Добавление ТТР к культурам клеток, в которых образовывется амилоид, снижало количество регистрируемого амилоида. Более того, в нескольких моделях болезни Альцгеймера на животных, комплексы были обнаружены в мозге и было продемонстрировано, что с увеличением уровня ТТР происходит уменьшение амилоида, выявленного в мозгу. Эти результаты позволяют предположить, что вещества, способные увеличить количество ТТР у больных болезнью Альцгеймера, могут привести к снижению амилоида и, таким образом, могут послужить прототипом лекарств для лечения болезни Альцгеймера.