Введение к работе
Актуальность проблемы.
Вопрос о существовании структурно-функциональных доменов в геноме эукариот обсуждается в течение последних 20 лет. В настоящее время считается общепризнанным, что существует несколько уровней компактизации хроматина в клетке. Одним из высших уровней организации хроматина являются квазизамкнутые петли ДНК размером в десятки тысяч пар нуклеотидов, закрепленные на скелетных структурах ядра (ядерном матриксе). Неоднократно высказывались предположения о том, что эти петли ДНК могли бы соответствовать функциональным доменам генома, таким как репликоны и транскриптоны. Многочисленные попытки проверить это предположение экспериментально привели, однако, к противоречивым результатам. Одной из наиболее очевидных причин этих противоречий является, на наш взгляд, отсутствие надежного метода картирования петельной организации генома. В большинстве исследований основания петель отождествлялись с фрагментами 0,НК, которые могут быть выделены в составе ядерного матрикса тосле жесткой нуклеазной обработки ядер. Правильность такого юдхода представляется, однако, сомнительной в свете ряда эезультатов, указывающих на то, что ДНК может временно ірикрепляться к ядерному матриксу в ходе осуществления различных рункциональных процессов. В этой связи не вызывает сомнения іеобходимость разработки новых подходов для характеристики :пецифичности организации хромосомной ДНК в петли, что и шилось главной целью настоящей работы.
Л,ель и задачи работы.
Цель данного исследования состояла в изучении специфичности срупномасштабной фрагментации генома высших эукариот Для того предстояло выполнить следующие экспериментальные задачи:
1- Исследовать крупномасштабную фрагментацию укариотического генома нуклеазой ВаІЗІ и сравнить ее с фрагментацией генома эндогенной топоизомеразой II.
2. Исследовать зависимость крупномасштабной фрагментации енома высших эукариот эндогенной топоизомеразой II от [ролиферативного статуса клеток.
3. Исследовать крупномасштабную фрагментацию эукариотического генома в процессе программированной клеточной смерти (апоптоза).
Научная новизна и практическое значение работы.
В настоящей работе' впервые продемонстрировано, что основания петель хромосомной ДНК предпочтительно доступны для нуклеаз, в том числе и для нуклеаз, узнающих неканонические структуры ДНК. Это открывает возможность использования дозированной обработки пермеабилизованных клеток нуклеазами для вырезания петель геномной ДНК и, таким образом, изучения специфичности организации ДНК в "петли. Новым также является демонстрация того, что при изменении пролиферативного статуса клеток происходят существенные изменения на уровне организации ДНК в петли. Впервые показано, что крупномасштабная фрагментация геномной ДНК на ранних стадиях апоптоза происходит специфически посредством вырезания петель ДНК и их олигомеров.
Результаты работы могут быть использованы для создания принципиально новых карт эукариотического генома, которые будут отражать принцип организации ДНК в петли. Разработанные подходы картирования петель ДНК позволят внести ясность в ряд спорных вопросов, касающихся соответствия петель ДНК функциональным единицам генома.
Апробация работы.
Работа была апробирована на следующих симпозиумах и конференциях: Первый международный конгресс по ядерному матриксу (Польша, июнь 1994), симпозиум по строению хромосомы Института Casuza Research (Япония, ноябрь 1994), симпозиум по ядерному матриксу и эпигенетической регуляции транскрипции (США, апрель 1995), Гордоновская конференция по хроматину и регуляции транскрипции (США, июль 1994), Школа молодых ученых в Черноголовке (февраль 1995).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано и находится в печати 8 работ.
Объем и структура работы.
Диссертация изложена на <ГЭ страницах машинописного текста и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, список литературы. Библиография включает 7С?/ источников. Работа проиллюстрирована -у о рисунками и j таблицами. '