Введение к работе
Актуальность темы. Сайт-специфические эндонуклеазы типа II,
явлляются важным инструментом для молекулярной биологии. Идет
постоянный поиск новых ферментов, так как обнаружение ферментов с
новой специфичностью расширяет возможности исследователей по
конструированию рекомбинантных ДНК, секвенированию и исследованию
полиморфных участков генома эукарио т ных организмов. Иногда
обнаружение новых ферментов с необычными свойствами влечет за собой возникновение новых генно-инжерных технологий или новых направлений исследования генома.
Но обнаружение ферментов с новой специфичностью представляет в
настоящее время довольно трудную задачу. Так в 1993 году из
примерно 250 объявленных ,сайт-специфических эндонуклеаз только 8
обладали новой специфичностью. Что касается ферментов узнающих
палиндромные последовательности, то были обнаружены представители
изомеров, узнающие 13 из возможных 16 тетрануклеотидов и 55 из
возможных 64 гексануклеотидов. Однако, если учитывать характер
расщепления палиндромного сайта, то оказывается, что для
тетрануклеотидных сайтов из 80 возможных случаев известны ферменты только для 17 изошизомерных подгрупп, а для гексануклеотидов из 320 случаев - только 63.Число ферментов, узнающих вырожденные по центральной паре пентануклеотидные последовательности мало, известноы ферменты узнающие только 11 пентануклеотидов из 288 возможных. Что же касается несимметричных последовательностей и прерванных палиндромов, то несмотря на огромное ч и ел о таких последовательностей, известны ферменты, узнающие только 79 из них. Обнаружено всего 8 ферментов, узнающих октанукл е от и дные палиндромы. Интерес к таким ферментам огромный в связи с развертыванием работ по анализу геномов эукариотных организмов, в частности с проектом "геном человека". Можно предполагать что такое малое количество ферментов, редко расщепляющих ДНК, обусловлено не их редкой встречаемостью в природе, а трудностью их детектирования в исходном экстракте исследуемого штамма при скрининге из-за присутствия в экстракте неспецифических эндонуклеаз, поскольку даже небольшая приме с ь таких ну клеаз способна разрушить высокомолекулярные фрагменты, образованные расщеплением субстратной ДНК высокоспецифичной, редко расщепляющей эндонуклеазой.
Поэтому в настоящее время с осбой актуальностью встает задача разработки новых методов скрининга коллекций микроорганизмов на присутствие редко-расщепляющих сайт-специфических эндонуклеаз. Что касается второго компонента систем модификации-рестрикции - сайт-специфических метилаз, то до последнего времени им уделялось незаслуженно мало внимания. Сейчас число охарактеризованных метилаз в десятки раз меньше чем число охарактеризованных сайт-специфи ч еских эндонуклеаз. В самое последнее время резко возрос интерес к биологической роли метилирования. Наряду с сайт-специфическими эндонуклеазами нетилазы могут стать важным инструментом генной инженерии. В к а честве примера можно привести технику расщепления ДНК по местам связывания специфических ДНК-связывающих белков,или методы редкого расщепления ДНК обычными сайт-специфическими метилазами после ее предварительного метилирования.
Все вышеприведенные факты показывают актуальность дальнейшего поиска продуцентов сайт-специфических эндонуклеаз и метилаз и всестороннего изучения этих ферментов.В качестве продуцентов таких ферментов с практической точки зрения особый интерес представляют термофильные микроорганизмы, поскольку, как правило, выделенные из них ферменты более стабильны и работа с новыми термофильными штаммами до их идентификации более безопасна. Задача исследования.
Задачей исследования были поиск новых продуцентов сайт-специфических эндонуклеаз и метилаз среди природных изолятов термофильных бактерий и изучение выделенных ферментов. Научная новизна. Проведен скрининг 67 штаммов из созданной коллекции штаммов термофильных микроорганизмов на наличие сайт-специфических эндонуклказ и метилаз.
В результате были найдены штаммы Bacillus
stearothermophilus Мб , Bacillus species КТ5 и Bacillus species
KT6, которые являются прдуцентами новых сайт-специфических
эндонуклеаз BstM6I, BspKT5I и BspKT6I, соответственно. Кроме того
из штамма В.Species КТ6 выделена ' сайт-спе ц и фическая
метилаза, парная эндонуклеазе Bsp KT6I. '
Разработаны схемы очистки вышеназванных -ферментов до функционально чистого состояния. Установлены точки расщепления узнаваемого сайта. Рестриктаза BstM6I узнает и расщепляет " нукпеотидяую последовательность CC-1'(A/T)GG и, следовательно,
является изошизонером Bst N1.
BspKT5I узнает на двунитевой ЛНК
5'-CTGAAG16N'1"
последовательность и расщепляет ее в стороне от
3'-GACTTCl4N1.
сайта, как показано стрелками, с образованием динуклеотидного 3'-выступающего конца. Эндонуклеаза Bsp KT5I является изошизонером Есо571, но в отличие от Есо5 71, она не стимулируется S-аденозилнетионином (SAM) и потому принадлежит к классу IIS, а не к классу IV, как Есо571 Это первый случай когда изошизомерные ферменты относятся к различным классам. Кроне того, в отличие от Есо 571, эндонуклеаза Bsp KT5I не обладает метилазной активностью.
Эндонуклеаза BspKT6I является изомером, но не изошизонерон, эндонуклеаз Say3AI и Mbo I . О на узнает на нолекуле ДНК последовательость GATC, но фернент отличается от всех известных изомеров Say3AI по характеру расщепления узнаваемой последовательности . В результате расщепления образуются 3'-выступающие динуклеотидные концы, идентичные концам фрагментов, образующихся при расщеплении ДНК эндонуклеазой Pvui. новый фермент отличен от Say 3AI по чувствительности к нетилированию ДНК. Dam-нетилирование ингибирует расщепление ДНК эндонуклеазой Bsp KT6I.
Выделенная из штамма В.Species КТ6 метилаза защищает ДНК от последующего расщепления эндонуклеазой Bsp KT6I. Метилируеным основаниен являются аденины.
Практическая ценность работы. Все полученные эндонуклезы очищены до функционально чистого состояния и ногут с успехом быть использованы для физического картирования нолекул ДНК, клонирования и секвенирования фрагнентов.
Поскольку рестриктаза Bsp KT6I является первым изомером Say 3AI, дающин динуклеотидные 3'-концы идентичные концан фрагментов ДНК при расщеплении эндонуклеазой Pvui, она может быть с успехом применена для составления банков генов путем интегрирования фрагментов неполного гидролиза клонируемой ДНК эндонуклеазой BspKT6I в уникальный сайт Pvui плазмиды pBR322 или ее производных.
Апробация работы. '-'... Результаты работы были доложены на Советско-германской синпозиуне по биотехнологии в мае 1993 года в г. Пущино.
Публикации. - -По материалам.диссертации опубликовано 4 работы.
Объем и структура диссертации. Диссертация включает в себя-введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты работы, выводы и список цитируемой литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит 2 таблицы и рисунков. Библиография включает 97 ссылок.