Введение к работе
Актуальность темы. Растущий интерес к бактериальным токсинам как специфическим белковым молекулам, избирательно поражающим эу-кариотические клетки, связан с их ведущей ролью в патогенезе ряда инфекционных заболеваний. Являясь важнейшими факторами вирулентности, токсины, продуцируемые бактериальной клеткой, способствуют ее выживанию в организме человека и животных. Поэтому ис-следов?ние генов токсинов и молекулярных механизмов,ответственных за их экспрессию, проливает свет не только на природу самих токсинов, но и на детали взаимоотношений паразита и хозяина.
При проникновении в клетку-мишень многие токсины используют те же пути, что и регуляторные белки (гормоны, факторы роста), и, следовательно, могут служить для изучения транспорта белков в эу-кариотическую клетку.
Изучение структурной организации молекул токсинов, большинство из которых состоят из двух или более компонентов,может быть полезным в выяснении процессов сборки сложных белковых систем и белок-белковых взаимодействий.
Исследования в этой области имеют и прикладное значение.Клонирование генов токсинов и определение их нуклеотидной последовательности открывает возможность создания методами генной инженерии дефектных токсинов, используемых для иммунизации, а также получения зондов, необходимых для дифференциальной диагностики заболеваний.Еще одной практически важной задачей является создание иммунотоксинов,которые могут быть использованы для направленного уничтожения определенных групп клеток, в частности, раковых.
Шига-токсин и шига-подобные токсины образуют семейство сходных цитотоксинов, продуцируемых рядом энтеробактерий, и, вероятно , являются самыми распространенными бактериальными токсинами в природе. Несмотря на то, что эти токсины интенсивно изучаются на протяжении последних нескольких лет, их структурные гены и механизмы, ответственные за экспрессию, до недавнего времени оставались относительно мало исследованными.
Цель работы- Исследование структурной и функциональной организации оперонов шига и шига-подобного токсинов.
Задачи. 1.Изучение положения генов шига-токеина и структуры прилегающих участков в хромосомах различных штаммов Shigella uy-senterlae 1.
-
Индукция лизогениого фага, определяющего продукцию шига-подобного I токсина в штамме Escherichia coll ЕРЕС 026:НП НЗО. Клонирование фрагмента ДНК, несущего гены токсина, и определение его нуклеотидной последовательности.
-
Сравнение нуклеотидных последовательностей структурных генов шига и шига-подобнго I токсинов, а также прилегающих участков.
-
Сравнительное изучение продукции токсин-специфических мРНК. Выявление механизмов, ответственных за неэквивалентную продукцию А и В субъединиц.
Научная новизна работы, В результате проведенной работы было показано, что гены, ответственные за продукцию шига-токсина, лежат на участке хромосомы, имеющем идентичную структуру у всех 10 исследованных штаммов Shigella dysenteriae 1 { из которых 13 -клинические изоляты ), причем во всех случаях гены шига-токсина тесно сцеплены с IS-элементом, родственным ІБбОО-алементу Shigella sonnei. Независимо в геномах присутствует 15-20 копий IS-эле-мента, причем все штаммы различаются по положению 1-2 копий. Было показано, что в штамме Escherichia col і ЕРЕС 026:1111 НЗО гены, ответственные за продукцию шига-подобного І токсина, входят в состав лиэогенного умеренного фага НЗО. Была определена нуклеотид-ная последовательность фрагмента ДНК, несущего эти гены, и проведено ее сравнение с соответствующими последовательностями из других токсин-конвертирующих фагов, а также с последовательностью фрагмента ДНК из Sh.dysenteriae 1 60R, несущего гены шига-токсина. Между участками ДНК, непосредственно прилегающими к оперонам шига и шига-подобного I токсинов выявлена значительная гомология. Показано, что на оперонах шига и шига-подобного I токсинов синтезируется бицистронная мРНК, причем для обоих оперонов одинаково положение ее 5'-концов, а также практически идентична картина ее
- деградации. В штаммах Sh.dysenteriae 1 60R и E.coll НЗО продукция токсин-специфических мРНК регулируется содержанием свободных ионов железа в среде. Приведены свидетельства в пользу регуляции неравного соотношения количеств субьединии А и В на уровне трансляции -
і Практическая ценность работы. Данные об организации генов шига токсина в геномах различных штаммов Sh.dysenteriae {в том числе и клинических изолятов) и шига-подобного I токсина в штам-
- з -ме E.coll EPEC 026:НП НЗО, а также о механизмах, определяющих продукцию токсинов, проясняют некоторые аспекты патогенеза дизентерии. Эти данные могут служить основой для получения штаммов-суперпродуцентов токсинов.Полуценные конструкции могут быть использованы для создания химерных генов токсинов, а зонды использованы в целях диагностики.
Апробация работы. Результаты доложены на 6-ом симпозиуме СССР-Италия "Макромолекулы в функционирующей клетке" (Ленинград, 1988г.), 8-ом симпозиуме СССР-ФРГ "Организация генома и регуляция активности генов" (Иркутск, 1989г.), 4-ом Европейском симпозиуме "Bacterial protein toxins" (Италия, Урбино, 1989г.) и 2-ой Всесоюзной конференции "Бактериальные токсины" (Юрмала, 1989г.). Основные положения диссертации обсуждены и представлены к защите на заседании коллоквиума отдела генетической инженерии ИМБ АН СССР 13 июня 1990 года.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы.