Введение к работе
Актуальность работы. Клетки всех организмов воспринимают многочисленные сиг-палы, передают эту информацию на соответствующие внутриклеточные компоненты и отвечают путем изменения метаболизма и роста. Одним из видов химических сигналов, воспринимаемых растеними, являются регуляторы роста. Их воздействие приводит к изменению скорости прорастания семян, модуляции роста и старения растения, определяет пол цветков, (ин)активирует ферменты, изменяет экспрессию генов. Изучение молекулярных событий, определяющих эффекты регуляторов роста растений, требует выяснения многих звеньев, вовлеченных в цепь передачи сигнала. Несмотря на последние достижения в решении этой задачи (например, обнаружения сходства этиленового рецептора с двукомпо-нентпой системой бактерий (Bleeker and Schaller 1996, Chang et al. 1996) и участия в передаче сигнала этилена каскада митоген активируемых протеин киназ (Mizoguchi et al. 1997) большинство этапов молекулярного уровня, вовлеченных в полный путь прохождения гормонального сигнала, до сих пор не известно.
Одним из регуляторов роста растений является фузнкокщш (ФК). ФК был открыт как продукт фитопатогенного гриба Fusicoccum amygdali Del, а позже затем был обнаружеп в растениях (Муромцев и др. 1980, 1986; Dabakov et al. 1994). Он стимулирует рост изолированных частей растений, усиливает транспирацию за счет раскрытия устьиц, способствует выходу семян из состояния покоя и ускорению их прорастания (Маггё 1979), индуцирует корнеобразовапие (Султанов и Муромцев 1985), повышает всхожесть семян в условиях, неблагоприятных для прорастания (Гупавардана и др. 1990, Вольпова и др. 1992, Леонова и др. 1994). На молекулярном уровне ФК активирует ІҐ-АТФазу (De Michelis et al. 1991, Johanson et al. 1993; Lanfermeijer and Prins 1994), блокирует проводимость калиевых каналов плазмалеммы (Blatt and Clint 1989) и активирует ігатрат-редуктазу (Moorhead et al. 1996).
В плазматической мембране всех высших растений локализованы специфические рецепторы ФК (Meyer et al. 1993), в формировании которых участвуют белки суперсемейства 14-3-3 (Мала et al. 1994, Korthout and De Boer 1994, Oecking et al. 1994). Плазмалемма многих видов растений содержит рецепторы двух типов - с низким (Ad ~ 100 нМ) и высоким
(Kq ~1 hM) сродством к ФК (Aducci et al. 1995). Благодаря быстрой активации ЬҐ-АТФазк плазмалеммы в присутствии ФК обычно предполагают более короткий и, вероятно, более простой путь транедукции сигнала по сравнению с другими фитогормонами (например, с ауксином) (Aducci et al. 1995). Было показано, что в сигнальном пути "ФК рецептор —s ІҐ-АТФаза" нет системы усиления сигнала (de Michelis ct al. 1996; Trofimova et al. 1997) r. что 14-3-3 напрямую взаимодействуют с С-термипальным доменом ІҐ-АТФазьі (Jahn et al 1997; Oecking et al. 1997). Т.к. in vitro ни НҐ-АТФаза, ни 14-3-3 белки по отдельности ш связывает ФК, то возникает вопрос какие молекулы являются определющими для образования ФК рецептора. Также оставались малоизученными рецепторы разной аффинноетт их сходства и различия, а также роль в клетке растений.
Цели и задачи работы. Все сказанное выше определило цели данной работы: выяснение организации ФК рецепторов разной аффинности в мембране растений и изученш изменения аффинности ФК рецептора под воздействием разных факторов. Для достиже-ния первой цели была применена методика определения молекулярной массы ФК рецепторного комплекса в мембране in situ - радиационная инактивация. Вторая часть ра боты выполнялась на протопластах, выделенных из суспензионной культуры сахарноі свеклы, - объекте максимально приближепном к клеткам по физиологической чувстви тельпости к ФК и позволяющем исследовать свойства ФК рецептора в плазматическоі мембране. Были поставлены следующие основные задачи исследования:
определить молекулярные массы ФК рецепторов разной аффинпости in situ;
выяснить роль белков 14-3-3 в формировании ФК-рецепторного комплекса;
исследовать физико-химические параметры рецептора ФК при воздействии внеш них стрессовых факторов на клетку;
на основании полученных данных построить модель организации ФК рецептора(ов в мембране.
Научная новизна и практическая значимость работы. В проведенных исследова ний обнаружен новый класс ФК рецепторов, активируемых при воздействии стрессовьп факторов на клетки растений, - "молчащие" ФК рецепторы. Методом радиациошюй инах тивации определены молекулярные массы высоко-, низкоаффинного и "молчащего" ре цепторов. Показано, что аффинность существующих в плазматической мембране рецепто ров ФК не постоянна, а меняется при различных стрессовых воздействиях на раститель ную клетку. Показано, что ФК может изменять молекулярную массу рецепторного ком
плекса, увеличивая степень взаимодействия между 14-3-3 белками и Н+-АТФазой плазма-леммы. Предложена модель рецептора ФК, в которой аффинность зависит от взаимодействия белков 14-3-3 и их белков-мишеней в рецепторном комплексе.
Практический интерес представляет экспериментальная разработка использования ФК как инструмента для исследования роли 14-3-3 белков и их межмолекулярных взаимодействий с белками-мишенями.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на заседаниях кафедры сельскохозяйственной биотехполопш ТСХА и отчетах лаборатории гормональной регуляции онтогенеза с.х. растений ВНИИСБ, на международной конференции "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии", на ежегодной конференции молодых учепых ТСХА (Москва, 1997), на симпозиуме общества физиологов растений "Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология" (Москва, 1997).
Публикации. По результатам выполненных исследований опубликовано четыре печатные работы, список которых приводится в конце автореферата.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Результаты", "Обсуждение" и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 94 страницах машинописного текста, включая 11 таблиц и 38 рисунков.