Введение к работе
-Актуальность проблемы. Повторяющиеся последовательности геномной ДНК эукариот открыты Бриттеном и Коном в 1968 г. Они были выявлены как фракция, способная к более быстрой ренатурации, чем остальная геномная ДНК.В. последующее десятилетие ряд исследовательских групп, работая с суммарными или слабо фракционированными препаратами повторяющихгія последовательностей ДНК (повторов), установил следующие основные факты. I. Повторы обычно составляют 20-70$ . ДНК любого эукариотического организма. 2. Число.копий в геноме варь-ируетдля разных семейств повторов от І02 до 10 . 3. Наряду с тандем-но организованными повторами (сателлитная ДНК) в большом количестве встречаются рассеянные по геному повторяющиеся последовательности. 4. У разных аукариот среднее расстояние между повторами заметно отличается (от 1000 до .15000 п.н.). 5. У подавлявшего большинства видов имеются как длинные (2-10хЮ3 п.н.), так и короткие (100-400 п.н.) повторы, б. Последовательности, гомологичные повторам, присутствуют в составе гетерогенной ядерной РНК и мРНК.
Были выдвинуты гипотезы, согласно которым повторы являются регуляторними элементшш, контролирующими транскрипцию или процессинг молекул про-мРНК (Georgiev,I969; Britten, Davidson,1969; Davidson, Britten, 1979 ). В 70-е годы эти гипотезы о структуре генов эукариот и регуляции их экспрессии были наиболее признанными. Это делало изучение коротких повторяющихся последовательностей ДНК актуальной проблемой молекулярной биологии эукариот.
Кроме того, незадолго до начала выполнения настоящей работы,
бНЛИ КЛОНИрОВаНЫ Некоторые Повторяющиеся Последовательности Droso-phila melanogaster (Tchurikov et al.t 1978, Finnegan et «І. 1978)» Все они оказались длинными (5-7 тыс.п.н.) рассеяными по геному в количестве 20-100 копий повторами. Неожиданно было обнаружено, что у мух разных линий некоторые копии этих последовательностей имеют различную локализацию в геноме ( Апапіет et ai.,1978 ). Таким образом, было установлено, что эти повторы дрозофилы представляют собой мобильные генетические элементы. Их с^али обозначать как мобильные диспергированные гены (ВДГ). Уже в то время было предположено, что МДГ, подобно инсерционным последовательностям и транспозонам бактерий, способны при интеграции внутрь гена или рядом с ним влиять на его работу. Все это делало важный и актуальным вопрос о том, не яв-
ляюі'ся ли мобильными генетическими элементами и повторы в ДНК млеко-пи таю'цих.
Наконец, имеется еще один аспект, делающий работу актуальной. Б 1972 г. Рысков и др., а также Джелинек и Дарнелл описали длинные двуспиральные участки в составе гетерогенной яде.рной РНК (гяРНК) клеток мыши и человека. (Препараты таких участков выделяли как материал устойчивый к действию РНК-аз А и ТІ). Были получены свидетельства в пользу того, что эти структуры представляют собой "шпильки" и транскрибируются с повторяющихся последовательностей ДНК. В молекулах мРНК длинные двуспиральные участки не обнаруживались, хотя детектировались последовательности, гомологичные им (Рысков и др.,1975). Делались предположения относительно участия длинных шпилечных структур в процессинге молекул про-мРНК. В 1977 г. Крамеров и др. разделили длинные двуспиральные участки гяРНК клеток мыши на две фракции (А и В), характеризующиеся разными размерами. Длина двуспиральной РНК типа к (дсРНК-А) была равной 300-1000 п.н. Длина двуспиральной РНК типа В (дсРНК-В) - 100-150 п.н. Опытами по перекрестной гибридизации было продемонстрировано, что два типа дву-спирадьных участков состоят из разных нуклеотидных последовательностей. Кроме того, оказалось, что, если двуспиральные участки типа Б действительно являются шпилечными структурами в составе высокомолекулярной гяРНК, то двуспиральные участки типа А представляют собой межмолекулярные дуплексы. В то же время выяснилось, что оба типа дсРНК транскрибируются с повторяющихся последовательностей ДНК. Хотя, как уназывалось,уже выдвигались некоторые предположения относительно функции длинных "шпилек" в молекулах про-мРНК, их природа, как и природа двуспиральных структур типа А, оставалась по сути совершенно неясной. Поэтому вопрос о том, что же собой представляют последовательности, образующие эти необычные структуры в молекулах гяРНК, весьма актуален.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение природы повторяющихся последовательностей генома мыши, гомолс гичных двуспиральным участкам гяРНК. В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи. I). Клонировать последовательности ДНК мыши, гнбридизующиеся с дсРНК-А и -В. 2). Определить первичные структуры этих последовательностей, если они не обладает слишком большой протяженностью. 3). Выяснить некоторые ас-
пекты эволюции этих последовательностей ДНК на примере ряда видов млекопитающих. 4). Установить,как распределены их транскрипты между, различными фракциями клеточных РНК. Определить размеры транскриптов.
В ходе изучения транскриптов была обнаружена необычная низкомолекулярная РНК, в связи с чем возникли новые задача: установление ее структуры, характера синтеза, ассоциации с белками.
Научная новизна и практическая ценность работы» При выполнении настоящей работы получен целый ряд новых и приоритетных научных данных.
С помощью клонирования в .клетках E..Coll геномной ДНК мыли были идентифицированы две гомологичные доРНК-В высокоповторяющиеся последовательности, обозначенные ВІ и В2 (1979 г). Таким образом, впервые были клонированы повторяющееся последовательности, рассея- . ные по геному позвоночного животного. Они же оказались первыми идентифицированными короткими повторами ДНК; Была определена иуклеотид-ная последовательность обоих повторов (1980 г и 1982 г), чуо позволило обнаружить ряд интересных структурно-функциональных черт, характерных для них. В частности были получены свидетельства в пользу того, что они являются мобильными генетическими элементами. Последовательности ВІ и В2, наряду о последовательностью Alu из генома человека ( Deinlpger at al., 1981), стали первыми известными представителями большого класса мобильных элементов, обозначаемых в настоящее время как регропозоны.
Обнаружено, что,помимо высокомолекулярных РНК (мРНК и про-мРНК), последовательности BI и В2 выявляются в составе низкомолекулярных лоли(А)-содериащих РНК (1982 г). Они были обозначены как BI и В2РНК, Вторая значительно более богато представлена . в клетках. Показано, что B2FHK входит в состззРНП-частиц и что ее содержание в опухолевых клетках обычно" значительно выше, чем в нормальных. Получены доказательства того, что эта РНК транскрибируется РНК-полимеразой Ш ' с многочисленных копий последовательности В2 (1984, 1985 г).В2РНК является первым примером транокрипта, синтезирующегося РНК-полимеразой I, и в то же время подвергающегося полиаденилированиго. Кроме того, ранее вообще не были известны какие-либо низкомолекулярныз полиаденилировашше РНК,
Обнаружено, что трифосфатн'ая группа на 5 -конце некоторой части иолекул В2РНК блокирована какой-то структурой, совершенно отличной от тех, которые встречаются в кэпах, характерных для транскриптов
РНК-полимеразы Д. Впервые установлено, что синтез заметной доли по-» ли(А)-содержащих РНК (в том числе и высокомолекулярных) устойчив к действию <=<~аманитина, что свидетельствует в пользу их синтеза РНК-полимеразоЙ Ш (1984 г).- Эти данные существенно меняют сложившие^ ся представления о типах РНК, синтезирующихся в клеточном ядре. Настоящая работа является одной из первых, посвященных сравнительному анализу клонированных повторов ДНК организмов разных видов (1980, 1986 г). С помощью гибрадизационных методов было установлено, что гомологи BI- и В2-повторов. мши детектируются в геномах представите-! лей подотряда мышеобразных грызунов, но не других млекопитающих. Исключение составляют приматы, для которых характерен гомолог В1-пов-тора. Обнаружено, что степень сходства ВІ-повторов у разных видов грызунов монет совершенно не соответствовать их таксономической близости.
Наконец» в настоящей работе были клонированы две повторяющиеся последовательности геномной ДНК мыши, гомологичные доРНК-А (1981 г). Как было показано, эти последовательности, обозначенные AI- и А2--элементшш, имеют большие разиеры - около ? тыс.п.н. Оказалось, что они идентичны последовательностям генома мыши, клонированным приблизительно в тот же период другими авторами. AI соответствует ИАЧ-элементу, кодирующему интрадистернальные А-частицы ( Она at ai., 1980, Ku et al», igai ), А2 соответствует MIFI -повтору ( Brovra, Dover,1981), или BamHI-повтору ( Panning, 1983), ИЛИ LI -элементу ( Voliva et al..,1984).Нами для этих длинных повторов генома мыши впервые показано следующее. В клетках транскрибируются обе цепи ДНК Я- и А2-элементов. Однако, транскрипты одной из цепей ДНК преобладают над транскриптами другой (асимметрия особенно выражена в случае AI-элемента). Транскрипты обоих элементов сильно варьируют по размеру. Набор транскриптов AI-элемента,может существенно отличаться в клетках разных опухолей. Транскрипты А2-элемента локализуются практически только в ядрах клеток (1984 г). Результаты работы легли в основу нового направления исследований, которое состоит в изучении рётропозонов и их транскриптов. Это направление в настоящее время интенсивно развивается целым рядом лабораторий. Некоторые из главных выводов работы приводятся в монографиях, служащих в качестве учебных пособий при прохождении курса молекулярной биологии.
Апробация работы. Ряд результатов диссертации вошел в цикл работ "Мобильные гены тавотных", удостоенный Государственной премии СССР за 1983 год. Кроме того, отдельные части настоящей работы были представлены на международных и всесоюзных форумах, в частности, на хыг и ТИП Симпозиумах по количественной биологии (Колд Спринг Харбор, 1980 и 1982 )", на ХЛ Конгрессе ФКБО (Москаа, 198*0, на 1U Европейском симпозиуме по опухолевым Вирусам (Варна, 1982), на У1 двустороннем симпозиуме СССР-ФРГ по структуре генома (Ленинград,1985), на УП и УН Всесоюзных симпозиумах по структуре и функции клеточного ядра (Харьков, 1980; Пущино, 1984) на У Биохимическом сьезде (Киев, 1985),
Структура и объем работы. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, раздела Материалы и методы, раздела Результаты, раздела Обсуждение результатов, Выводов и Списка литературы (444 ра-» бот). Работа изложена на 31? страницах, -включая 63 страницы с иллюстрациями, которые состоят из 61 рисунка и б таблиц.