Введение к работе
Актуальность проблемы. Мобильные генетические элементы составляют существенную часть генома эукариот На их долю у различных организмов приходится от 10 до 90% всей геномной ДНК У Drosophila melanogaster 10% генома оккупировано мобильными элементами Взаимодействия мобильных генетических элементов с геномом хозяина весьма сложны С одной стороны, мобильные элементы могут встраиваться в кодирующие последовательности, нарушая их структурную целостность, а поскольку они несут собственные сигналы инициации и терминации транскрипции и трансляции, а также могут содержать разнообразные регуляторные последовательности, такие как энхансеры, сайленсеры и инсуляторы, то присутствие мобильного элемента вблизи гена также может сильно повлиять на его экспрессию Считается, что в основном, в условиях стабильности среды обитания, перемещения мобильных элементов приводят к негативным последствиям С другой стороны, транспозиции мобильных элементов полезны для популяции хозяина в условиях изменяющейся окружающей среды, так как они являются важным фактором эволюции, участвуя в рекомбинационных процессах
Спонтанные транспозиции мобильных элементов происходят относительно редко, с частотой, как правило, не превышающей 10 , что свидетельствует о наличии систем жесткого контроля за перемещениями мобильных элементов со стороны клетки В некоторых случаях частота спонтанных перемещений заметно выше, что, по-видимому, является следствием нарушения работы системы контроля Повышение частоты перемещений может происходить у потомков от особых скрещиваний (эффект получил название гибридного дисгенеза), когда нарушается сложившийся механизм репрессии транспозиций продуктом самого элемента, и в особенных линиях, названных генетически нестабильными, в которых происходят нарушения нормального функционирования системы клеточного контроля Исследование одной из таких линий (названой MS, Mutator Strain) и стабильной линии SS (Stable Strain), из которой была получена линия MS, показало, что генетическая нестабильность в данной линии связана с мутацией тема flamenco [Ilyin et al, 1991, PrudTiornme et al, 1995], играющего ключевую роль в контроле перемещений ретротранспозона МДГ4 с использованием механизмов РНК интерференции, в соответствии с недавно предложенной моделью своеобразного иммунитета к транспозициям мобильных элементов [Brennecke et al, 2007]
Мобильный элемент МДГ4 Drosophila melanogaster, в англоязычной литературе известный как gypsy, относится к классу ДКП-содержащих ретроэлементов Он использует РНК-интермедиат для транспозиции, содержит три открытых рамки считывания, аналогичных ретровирусным генам gag, рої и env, и жизненный цикл ею аналогичен
ретровирусному Также имеются экспериментальные данные, свидетельствующие в пользу того, что этот ретротранспозон является эндогенным ретровирусом дрозофилы [Kim et al, 1994] Несмотря на то, что ретровирусы и ретротранспозоны довольно давно являются объектом пристального внимания исследователей, взаимоотношения на генетическом уровне между ретротранспозонами и ретровирусами и их хозяевами по-прежнему являются по большей части загадкой Поэтому обнаружение эндогенных ретровирусов у дрозофилы, являющейся классическим модельным объектом, открывает новые широкие горизонты для исследования генетического контроля со стороны хозяина за перемещением ретроэлементов
Ранее было обнаружено, что ретротранспозон МДГ4 имеет два четко различимых подсемейства, отличающихся ретротранспозиционной активностью, и получивших названия «активный» и «неактивный» [Lyubomirskaya et al, 1993] Исследование распределения двух вариантов элемента в 21 линии дрозофилы показало, что «неактивный» МДГ4 является эволюционно более древним, и, по всей видимости, «активный» вариант образовался из «неактивного» путем накопления точечных мутаций [Lyubomirskaya et al, 2001] Однако в том же исследовании была обнаружена одна линия (Г32), которая содержала необычный вариант МДГ4, появившийся, скорее всего, в результате рекомбинационных процессов Исследование полиморфизма полноразмерных копий МДГ4 является актуальным, так как позволяет пролить свет на происхождение измененных форм элемента, способных преодолевать жесткий контроль со стороны клетки, а изучение неканонических копий МДГ4 позволит подойти к вопросу о происхождении гетерохроматических последовательностей ретротранспозонов, представление о роли которых сегодня существенно меняется
Цель и задачи исследования.
Целью данного исследования явилось изучение структурных особенностей ретротранспозона МДГ4 (gypsy) в линии Г32 Drosophila melanogaster, а также в различных видах рода Drosophila подгруппы melanogaster с целью установления возможного источника «активного» варианта МДГ4 В соответствии с целью в работе были поставлены следующие задачи
провести скрининг ранее созданной геномной библиотеки линии Г32 на основе
бактериофага X и отобрать клоны, имеющие гомологию с МДГ4,
провести рестрикционно-гибридизационный анализ полученных клонов с целью выявления
полноразмерных копий и общей характеристики неканонических вариантов последовательностей МДГ4,
определить первичную структуру нуклеотидных последовательностей, фланкирующих
клонированные копии МДГ4, с целью их локализации в геноме,
определить принадлежность клонированных полноразмерных вариантов МДГ4 из линии
Г32 к «активному» и «неактивному» подсемействам,
определить нуклеотидную последовательность и провести сравнительный анализ
полноразмерных вариантов МДГ4 из линии Г32 и доступных из баз данных в сети Интернет,
получить методом ПЦР, клонировать фрагменты ОРСЗ МДГ4 из различных видов рода
Drosophila подгруппы melanogaster, определить первичную структуру их ДНК на предмет принадлежности к «активному» или «неактивному» подсемейству МДГ4,
построить филогенетическое древо МДГ4 из различных видов рода дрозофилы на
основании клонированных последовательностей ОРСЗ и сравнить его с древом рода
Drosophila подгруппы melanogaster
Научная новизна и практическая ценность работы.
Данная работа посвящена исследованию полиморфизма эндогенного ретровируса МДГ4 в линии Г32 Drosophila melanogaster, сравнению различных опубликованных вариантов МДГ4 и анализу элемента из некоторых других видов подгруппы melanogaster рода Drosophila Последовательности ретроэлемента МДГ4 обнаруживаются в геноме практически всех видов рода дрозофила, однако, лишь некоторые из них представляют собой неповрежденные полноразмерные и, следовательно, способные к активной транспозиции, копии Таким образом, с одной стороны получается, что МДГ4 (точнее его очень древний предшественник) является давним «жителем» генома дрозофилы С другой стороны, его современный вариант, скорее всего, распространился в геномах дрозофил не так давно Наличие двух четко различимых подсемейств, «активного» и «неактивного», привносит еще большую интригу в ситуацию вокруг МДГ4 и его происхождения
В ходе данной работы из генома линии Г32 Drosophila melanogaster выделены 28 уникальных клонов, имеющих гомологию с МДГ4 Из них четыре оказались впервые клонированным ретротранспозопом gtwm и были исключены из данной работы Остальные клоны были проанализированы и классифицированы
Рестриктный анализ выявил 4 полноразмерных копии МДГ4, 2 из которых принадлежат к «неактивному», а 1 - к «активному» подсемействам этого ретроэлемента 4-ая копия МДГ4 - «химерная» - имеет характерные особенности, свойственные обоим вариантам МДГ4 Остальные 20 клонов содержали гетерохроматические последовательности, большинство из которых имеет гомологию с практически полным МДГ4 и, по-видимому, являются компонентом недавно выявленной системы своеобразного иммунитета клетки к транспозициям МДГ4, использующей механизмы РНК-интерференции
Анализ нуклеотидной последовательности четырех полноразмерных вариантов МДГ4 из линии Г32 и сравнение их с доступными в базах данных сети Интернет показал, что все известные до сих пор варианты элемента можно строго отнести к одному из подсемейств, в то время как полученные из библиотеки линии Г32 полноразмерные клоны, хотя их и можно было отнести к «активному» или «неактивному» варианту, имели и замены, характерные для противоположного типа, а также ряд общих для всех вариантов замен, характерных только для данной линии На основании этих, а также ряда данных, полученных в рамках других исследований линии Г32, можно полагать, что в этой линии, по всей видимости, образуется большое количество разрывов ДНК, наличие которых активизирует рекомбинационные процессы, в частности генную конверсию, и перемещение LINE-подобных ретротранспозонов
Для установления возможного источника эволюционно более молодого «активного» варианта МДГ4 были получены фрагменты ОРСЗ различных видов рода Drosophila подгруппы melanogaster Анализ нуклеотидной последовательности полученных фрагментов свидетельствует о том, что «активное» подсемейство присуще только виду Drosophila melanogaster Сравнение филогенетического древа МДГ4, построенного на основании полученных фрагментов ОРСЗ, с общепринятым древом рода Drosophila подгруппы melanogaster выявило определенное несоотвествие в одной из ветвей на фоне, в целом, существенного совпадения
Полученные данные открывают ряд возможностей для дальнейших исследований эволюции как самого мобильного элемента МДГ4, так и системы клеточного контроля его перемещений Также большой интерес представляют дальнейшие исследования линии Г32 Drosophila melanogaster, имеющей ряд генетических особенностей, одной из которых является повышенная частота рекомбинационных процессов
Апробация результатов. Материалы диссертации были представлены на XII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005» (Москва, апрель 2005)
Публикации По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах
