Введение к работе
Актуальность проблеми. Поиск мер запиты растений от вирусной инфекции привел к разработке технологии предусматривающей инженерию растений, которые сакси синтезируют эндогенный продукт, инги-биругаций развитие вируса в клетках хозяйка. Практический интерес в этом плане представляют сельскохозяйственные растения, в частности картофель.
Традиционные способы защиты растений о? фитопатогенкых вирусов, включающие различные агротехнические 'мероприятия, селекцию растений, Еыращивание безнируснсго посадочного материала, применение химических веществ, антибиотиков, вещгств биологического происхождения не всегда приводят к желаем: їм результатам и имеют ограничения в использовании. Тоже полно сказать и о методе перекрестной защиты растений от вирусов.
В настоящее время наиболее эффективны.! способом зашиты растений от Еирусного поражения путем переноса чужеродных генов в растения является экспрессия гена белка оболочки различных вирусов в клетках растений. Хотя механизмы возникновения ви-русоустойчивости у таких растений еще недостаточно изучены, однако, было показано, что этот признак стабилен и наследуется в последующих поколениях. Имеются литературные данные указывающие на достаточно эффективное использование для подавления зирусной инфекции у трансгенных растений антисмысловых РНК гена белка оболочки вирусов.
Недостаточно пока еще изучено влияние на фитопатогенные вирусы как экзогенного так и эндогенного интерферона, что не позволяет сделать окончательный вывод о перспективности использования такого способа защиты растений от вирусной инфекции.
Данная работа связана с изучением влияния экспрессии гена белка оболочки Х-вируса картофеля в прямой и обратной ориентации относительно промотора, а также экспрессии гена человеческого лейкоцитарного альфа-2 интерферона на вирусоустойчивость трансгенных растений картофеля к Х-вирусу картофеля.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось получение трансгенных растений картофеля ( Solanum tuberosum ) сортов Темп, ЛьЕОвянка, Свлтанок, Sapeso с чужеродными генами : а) геном белка оболочки Х-вируса картофеля в прнмой і: обратной ори-
ентации относительно промотора } б) геном человеческого лейкоцитарного альфа-2 интерферона. Изучить влияние продуктов экспрессии данных генов на вирусоустойчивость трансгенных растений. В соответствии с этим были поставлены следующие вадачи :
-
подобрать условия трансформации и регенерации растений картофеля ;
-
осуществить перенос и экспрессию гена белка ободочки Х-вируса картофеля в прямой и обратной ориентации в растения картофеля сортов Темп, Свитанок, Зарево и Львовянка ;
-
осуществить перекос и экспрессию гена человеческого лейкоцитарного альфа-2 интнрферона а растения картофеля сорта Львовянка |
-
изучить свойства., вирусоустойчивости у полученных трансгенных растений картофеля к Х-вирусу картофеля ;
Б) провести анализ трансгенных растений картофеля в полевых условиях.
Научная новизна ц практическая ценность работы. Получены трансгенные растения Картофеля широко районированных сортов Темп, Свитанок, Зарево и Львовянка ( вида Solanum tuberosum ) с геном Селкз ободочки Х-вируса картофеля в прямой ориентации относительно 35S промотора и промотора гена акстенсина моркови ; с геном Оедка оболочки Х-вируса картофеля в обратной ориентации относительно 35S промотора ) и с геном человеческого лейкоцитарного альфа-2 интерферона под контролем 35S промотора и промотора гена акстенсина моркови.
Впервые подучены трансгенные растения широко районированных сортов картофеля, устойчивых к варааэнкю Х-вирусом, кртофеля с чужеродными генами белка, оболочки Х-вируса картофеля и геном Человеческого лейкоцитарного альфа-2 интерферона. Показано, что данные трансгенные растения в разной степени обладают устойчивостью к Х-вирусу картофеля. Впервые продемонстрирована возможность защиты трансгенных, растений картофеля с геном белка оболочки Х-вируса картофеля в обратной ориентации относительно промотора от поражения Х-вирусом картофеля при значительных инфекционных нагрузках.
Полученные трансгенные растения были проанализированы в полевых условиях. Показано, что урожайность трансгенных растений в среднем не нихэ таковой исходных ^трансформированных растений картофеля соответствующих сортов.
Дании? результаты позволяют использовать созданные трансген-ныэ растения картофеля для получения новых сортов картофеля, устойчивых к вирусной инфекции.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на Всесоюзной конференции " Новые направления в биотехнологии ", г. Пуияно, 1990 ; на I Всесоюзном симпозиуме " Новые направления биотехнологии растений ", г. Пушино, 1991; на Международном конгрессе по культуре клеток и тканей, г. Амстердам, 1990; на Международном симпозиуме по протопластам, г. Уппсала, 1991; а также на научных семинарах отдела клеточной селекции Института клеточной биологии и генетической инженерии АН Украины.
Автор выражает глубокую признательность сотрудникам Центра " Бисиняенерия " АН СССР О. А. Щульге и Р. 3. Гизатуллину, сотрудникам ИМБиГ АН Украины Т. В. Степаниииной и М. It Терецэнко, заведующему отдела фитопатогенных вирусов растений ШВ АН Украины И. С. Цэрба-тенко, заведую^эму группой отдела вирусных и грибных болезней растений Укр. ШШ с/х микробиологии Н. Ы. Заріщкому, а такжэ всем сотрудникам отдела клеточной селекции Института клеточной биологии и генетической гатенерии АН Украины за большую помощь, оказанную при выполнении работы.
Структура и обьем работы. Диссертация состоит из зведений, обзора литературы, экспериментальной части, результатов, обсуиде-ния, выводов и списка литературы, включахаззго 111 наименований. Работа изложена на 103 страніщах мавинописного текста и содержя Z1 рисунок и 3 таблицы.
ШЁРИАЛЫ И 1ЕТ0ДУ. Характеристика растительного материала и плазмидных векторов. исподьзуемьас н работах по трансформации. .
В работе был использован культурный тетраплоиднкй вид Solatium tuberosum, сортов: Зарево, Свитанок, Темп, Львозянка. Материал подучен из коллекций Украинского научно-исследовательского института картофельного хозяйства ( пос. Немешаево Киевской обл. ) и Белорусского научно-исследовательского института картофельного и Плодоовощного хозяйства ( пос. Самохваловичи Шнекой обл. ).
Трансформацию растений картофеля проводили используя плагчи-ду Bin 19 ( Bevan., 1934 ) с клонированным фрагментом кДНК вирусного генома, содержащим ген белка оболочки ХЕК с полной З'-нетранслируемой областью включая поли-(А17) и 54 нуклеотидами
- 4 -б'-нетранслируемого района. З качестве регуляторних элементов использовали промотор и терминатор 3SS РНК ЕМЦК в конструкциях с прямой и обратной ориентацией гена относительно промотора ( Щупь-га., 1Э91 ) и промотор гена экстенсинз моркови в конструкции с. прямой ориентацией гена ( Гнзатуллнн. , 1090 ).
Для переноса гена челсвечэского лейкоцитарного альфа-2 интерферона в растения использовали тот же плаэмлдный вектор Bin 19 с клонированным геном человеческого лейкоцитарного альфа-2 интерферона под контролем 25S промотора и промотора гена экстенсина моркови ( Гизатуллин., 1950 ).
Все плаэмидные конструкции переносили в штамм Agrobacterium tumefaciens LBA 4404, который в дальнейшем использовался для трансформации растений картофеля.
Плаэмидные конструкции Сули любезно предоставлены сотрудниками Центра " Еиоин.женерия " О. А. Щульгой и Р. 3. Гнзатуллиным.
Трансформация картофеля.
Трансформацию картофеля проводили по упрошенной схеме с модификациями путем кокультивирования стеблевых сегментов растений картофеля с A. tumefaciens, используя за основу метод, предложенный М.Де Елок ( De Block, 1988 ).
Анализ ядерной ДНК, трансформированных растений.
Выделенную и очищэнную ДНК растений-регенерантов (Dellaporta et al. ,1983) анализировали на присутствие чужеродного гена методом бдот-гибридиэации по Сауеерну ( Southern, 1S75 ).
Анализ РНК трансгенных растений.
Определение мРНК гена белка оболочки в суммарном препарате РНК, выделенном из тканей трансгенных растений ( Verwoerd et al., 19S9 ) проводили, используя метод РНК-ДНК' блот-гибридиэации ( Мандатне и др., 1934 ).
Определение белка ободочки Х-вируса картофеля в. тканях трансгенных растений.
По описанной методике ( Hoekeira et al., 1989 ) из тканей трансгеннх растений получали суммарный белковый препарат. С последующей стадией иммуноблот-аналиаа Селок оболочки в белковом экстракте тестировали кроличьей антисывороткой.
Определение человеческого лейкоцитарного альфа-Z интерферона в тканях трансгенных растений.
В гомогенате тканей трансформированных растений картофеля интерферон был определен стандартньм икыунэфершнтным методом
- 5 -( Tijssen, 1935 ). Мышные моноклональные антитела к альфа-2 интерферону связанные с Сета-галактоэидаэой Е. сої і были любезно предоставлены Терещенко М.И. ( Отдел регуляторних механизмов клетки ІШБ АН Украины ).
Цитогенетическии анализ.
Препараты готовили в соответствии с методами, предложенными А. Мурас и др. ( Ktouras et al., 1987 ), окрашивали 0,3 t-ным красителем Гимаа.
Определение инфекционности экстрактов иэ листьев трансгенньпс растений на индикаторном растении,
В определении использовали киевский штамм ХЗК ( ПЬлудько И др., 1967 ) и индикаторное растение Gomphrena glofcosa.
ХВК размножали на растениях дурмана Datura stramonium L..
Определение количества вирусных частиц в тканях, инокулиро-ванных вирусом растений.
Уровень накопления вирусного антигена в опытных И контрольных растениях определяли с помочью иммуноферментного метода ( Clark, Adorns, 1977 ). Для этой цели использовали готовые имму-ноферментные диагностикумы ( Научно-производственное объединение по картофелеводству, пос. Корнеево, Московская обл. ). Оценку результатов проводили с помощью фотометра ИФКО-2 ( СССР ) при длине волны 490 ни.