Введение к работе
Актуальность проблеми.
Исследователи, занимающиеся проблемами экспрессионного клонирования в бактериях, встречаются в ходе решения поставленных вадач о рядом трудностей, мешающих успешному достижению конечной цели -получению в клетках Ошггерий препаративных количеств полноценных и биологически активных белковых продуктов чужеродных генов. К числу подобных проблем относится отсутствие в прокариотических клетках системы посттрансляциониого процесскнга мРНК, что делает невозможным получение полноценного белка - продукта эукаркотического гена, кмекпгэго мозаичную структуру, при непосредственном введении последнего в клетки бактерий. В настоящее эреыя существует ряд методических подходов, способствующих преодолению данной проблемы -это: 1) штоды непосредственного удаления нитронов из геномных генов (путем искусственного мутагенеза или через введение геномного гена в состав ретровируского челночного вектора); 2) химико-ферментативный синтез генов с запланированным строением, максимально приспособленным для последующей экспрессии в бактериях; 3) получение кДНК-кошга гена с помощью обратной транскрипции его мРНК. Эднако вызеупомянутые методические подходы обладают рядом недо-гтатков: трудоемкостью и дороговизной экспериментального процесса, необходимостью получения количеств ДНК гена, достаточных для последующего клонирования в составе экспрессионного вектора, а также левозможностыо удаления очень протяженных интронных последовательностей (при использовании методов непосредственного деинтронирова-яия). Разработанный в середине 80-х годов метод амплификации ДНК ^средством полимеразной цепной реакции (ГЩР) в его приложении к задачам экспрессионного клонирования лишен недостатков, присущих вышеупомянутым методикам, и обладает рядом несомненных достоинств, к числу которых превде всего относятся быстрота проведения эксперимента, простота метода, наличие крайне малых количеств ис-содной матричной ДНК, на основе которой путем амплификации можно » 5ыстро получить достаточные для последующей работы количества тужного фрагмента ДНК, а также независимость метода от разме-
-4.-
ров лнтронных последовательностей и возможность введения в состав ашлифицируемого гена необходимых регуляторній элементов для обеспечения его эффективной экспрессии в прокариотических клетках.
Среда проблем, затрудняющих экспрессии чужеродных генов в бактериальных клетках существует одна, которая заключается в обра-вовании неопгишльной вторичной структуры Б*-концевой области мРНК, транскрибируемой с чухкродного гена. Щш этом в формирование "шпилечных" структур вовлекаются последовательности регуляторних элементов инициации трансляции, что затрудняет инициацию синтеза белка рибосомами. Данная проблема успешно решается с использованием полицистронных экепрессионных векторов, в составе которых эффективность экспрессии дистального по отновени» к промотору цист-рона, образованного клонированным геном, достигается в результате реализации принципа "трансляционного сопряжения" и не зависит от характера вторичной структуры мРНК. Созданная недавно векторная пдазмида pPR-TGATG-І обеспечивает высмвде уровни экспрессии целевых генов за счет эффективной рвинициации рибосомами трансляции дистального по отношении к промотору цистрона, образуемого геном-вставкой в результате частичного перекрывания стоп-кодона (ISA) проксимального и стартового кодона (ATG) дистального цистро-нов.
Цель работы.
Целью данной работы являлась разработка простого и надежного метода удаления интронов посредством ПЦР на примере сборки структурного гена ингерлейкина-1человека (hIL-lj3 ) и конструирование экспрессионкого вектора pPRll4, основанного на принципе " трансляционного сопряжения", с получением в клетках Е. сої і биологически активных белковых продуктов генов hIL-ip, интерлейккна-3 человека (hIL-З) и гамма-интерферона Оыка (blNF-y) с использованием данного вектора.
Научная коБиэяа и драктическая ценность работы.
Настоящая работа является частью комплексных исследований по клонированию и экспрессии различных лимфокинов. проводимых во ВНИИ генетика совместно с Институтом, биоорганической химии им. U.M. Шемякина РАН. IL-1 - белковый фактор, необходимый для стиму-
кирования ранних этапов организации иммунного ответа. IL-3 - муль-гиколониестимулируший фактор, возлействукщий на полипотентные :тволовые клетки костного мозга на различных стадиях их роста и цифференцировки. INF-jf - иммуномодулятор, играющий важную роль в іроцессах супрессии и активации иммунного ответа, а также являючися противоопухолевым, антивирусным, антимикробным, противопара-зитарным и антипролиферативньм агентом. Вышеперечисленные свойства данных цитокинов делают крайне перспективным их использование при печении широкого крута раковых, инфекционных, аллергических и іутоишунньос заболеваний, иммунодефицита организма, нарушений функций кроветворения и патологических изменении состава крови. )чистка данных белков из природных источников - трудоемкая и неэкономичная процедура ввиду низкого содержания цитокинов а живог-шх тканях. Поэтому для получения массовых количеств этих факто-хзв, достаточных для широкого клинического использования, очень гдобно применение генно-инженерных подходов, направленных на полу-іение бактериальных, штаммов-продуцентов важных в клиническом от-юшении лимфокинов. Кроме того, конструирование штаммов-продуцентов данных белков имеет большое значение для изучения молекуляр-ю-биологических основ их роли в живом организме.
Объем работы.
Диссертационная работа излокена на 146 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой мтературы, состоящего из 240 ссылок,