Введение к работе
Актуальность проблемы. Совершенствование методов генетической трансформации растений и технологии рекомбинактных ДНК сделали возможным экспрессировать в растениях гены различных организмов, что открывает перспективы для создания растений с новыми уникальными свойствами. Сахарная свекла (Beta vulgaris L.) относится к важнейшим сельскохозяйственным культурам, являясь основным продуцентом сахара в зонах умеренного климата. Проводимые с сахарной свеклой селекционно-генетические работы направлены на повышение продуктивности и на обеспечение растений устойчивостью к фитопатогенам и различным биотическим и абиотическим стрессовым факторам. Относительно медленные темпы классической селекции новых сортов сахарной свеклы связаны с такими ее генетическими характеристиками как высокая гетерозиготность, перекрестная опыляемость и двухлетний цикл развития.
В настоящее время открывается реальная перспектива создания новых сортов принципиально новыми методами генетической инженерии. С помощью этих методов начато решение практических задач получения сахарной свеклы с повышенной сахаристостью, устойчивостью к свекловичной нематоде, вирусным инфекциям, насекомым-вредителям и гербицидам (Thomas, 1991). Однако большинство этих задач решается пока в экспериментах на уровне трансформированных пртопластов (Ingersoll et al., 1996), и растений, культивируемых in vitro {Jacq et al., 1992).
Разработка методов регенерации целых растений из клеток и тканей в культуре in vitro является одним из необходимых условий получения трансгенных растений. Сахарная свекла относится к трудным для экспериментов in vitro видам растений (Tetu et al., 1987), Описанные примеры получения трансгенных растений сахарной свеклы немногочисленны. Информация о существовании методов генетической трансформации отечественных сортов сахарной свеклы вообще отсутствует. Вследствие этого возникает необходимость более широко проводить исследования по совершенствованию методов регенерации и генетической трансформации этой культуры.
Разработка методов генной инженерии сахарной свеклы будет способствовать проведению фундаментальных исследований по биохимии, генетике и физиологии этой культуры, что откроет перспективы по созданию новых сортов и генотипов.
Цель и задачи исследований. Целью данной работы являлось
разработка метода генетической трансформации отечественных сортов
сахарной свеклы.
ЦЕНТРАЛЬНАЯ""— НАУЧЧлл L-S;i,iOTE:^A
и-j. it, А. ідк.ііijj,.іззз^
—^~?
Для выполнения этой работы решали следующие задачи:
-
Разработать методику регенерации растений сахарной свеклы из различных эксплантов и оценить регенерационный потенциал некоторых отечественных сортов.
-
Исследовать присутствие в экссудатах сахарной свеклы специфических сигнальных молекул, индуцирующих контролируемый vir- генами процессинг агробактериальной Т-ДНК. Определить сорта и экспланты сахарной свеклы с высокой vir-индуцирующей активностью.
-
Разработать методику генетической трансформации сахарной свеклы с помощью агробактериальных векторных систем.
-
Исследовать эффект ассоциативных метилотрофных бактерий Methyiovorus mays на регенерацию и агробактериальную трансформацию сахарной свеклы.
-
Получить трансгенные растения сахарной свеклы, экспрессирующие наряду с селективными маркерными генами также гены, определяющие ценные хозяйственные признаки Провести молекулярно-генетический анализ трансгенных растений.
Научная новизна работы, В результате проведенных
исследований изучен регенерационный потенциал 4 сортов сахарной свеклы отечественной селекции - Ялтушковская 34, Льговская 52, 1&7р47 и N16. Отобраны сорта с высоким регенерационными характеристиками Исследуемые сорта сахарной свеклы проанализированы на присутствие у них сигнальных соединений, индуцирующих процессинг агробактериальной Т-ДНК. Определены сорта и экспланты с высокой индуцирующей активностью. Разработана методика колонизации метилобактериями Methyiovorus mays растений, культивируемых in vitro. Установлено. что колонизация метилобактериями увеличиваеі эффективность и частоту регенерации сахарной свеклы. Применение методики колонизации в системе агробактериальной трансформации сокращает сроки культивирования и увеличивает частоту трансформации.
Проведено молекулярное клонирование гена антимикробного пептида цекропина Р1 в растительный вектор pGA482 под контроль 35S промотора вируса мозаики цветной капусты. Полученные плазмида перенесены в штаммы агробактерий А281 и GV3101, Получень трансгенные растения сахарной свеклы, содержащие маркерный ген nptll ген bar устойчивости к гербициду фосфинотрицину (BASTA) \ трансгенные растения, содержащие ген антимикробного пептиді цекропина Р1. Проведен молекулярно-генетический анализ трансгенньи растений.
Практическое значение работы. Разработанная система
трансформации может быть использована для переноса в геном сахарной
свеклы чужеродных генов, определяющих хозяйственно-ценные
призи л кн. а также способствует проведению фундаментальных
исследований по генетике и биохимии этой культуры,, что открывает
перспективы по созданию ее новых сортов и генотипов.
Комбинированное использование бактериальной колонизации и
агробактсриальной трансформации сомаст основу для новых технологий
культивирования растений in vitro.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных
работ.
Апробация работы. Материалы данной работы были представлены на 111
и V конференциях молодых ученых (Пущино. 1998, 2(ХИ), на III, IV, V
чтениях, посвященных памяти академика Ю,А. Овчинникова (Пущино.
1997. 1998. 2000). на II Международной конференции «Биотехнология в
растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва. 20(№), на VII
Международной конференции «In vitro Plant Cell Biology. Biotechnology
and Gcnnplasm Preservation» (Москва. 1997) и на Международной
конференции «Molecular Mechanisms of Stress Responses in Plants»
(Москва. 1998).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения.
