Введение к работе
Актуальность исследования. Разработка новых методов для ведения репортерных групп в белки с целью их исследования 111-іичєскими методами (ЯМР. ЭПР. флуоресценции, кругового дихроизма і др.) открывает новые перспективы для изучения белков. Эти ютоды должны давать возможность получения структурных аналогов іелков, содержащих репортерше группы, в идеале не затрагивающие їх нативную структуру.
В этом отношении большой интерес представляет введение прилюдных хромофоров (триптофан, тирозин и фенилаланин) генно-инже-герными методами, отбор мутантних белков с незатронутой нативноя структурой и их исследование физическими методами с целью изуче--шя структуры природных белков.
В настоящей работе попробовали ввести природный хромофор Суг в N-концевуті часть белка L7/L12, чтобы исследовать его структуру методом 1Н-ЯМР, флуоресцентной спектроскопии и кругового дихроизма. Белок 1/77112 является довольно хорошо изученным белком в отношении его структуры, локализации на рибосомах и функционирования. Это маленький рибосомный белок с молекулярным весом (2200, который в растворе и на рибосомах находится в ди-мерной форме и представляет собой стержень 50S рибосомной субчастицы E.coli. Белок L7/L12, кислый рибосомный белок, представлен в четыри копия на рибосомах в виде двух димеров.
Для димера белка L7/I12 предложены две модели - параллельная и антипараллельная укладка цепей мономеров в димере. Ы-кон-цевая часть белка L7/L12 ответствена за димеризацию и за образование комплекса с белком L10 (L7/L12)4.L10.
Мономер белка L7/I12 построен из двух доменов - глобулярного С-концевого домена, включающего остатки 53-120, и неглобулярного, вытянутого н'-концевого домена, состоящего из остаков 1-36. N-и С-концевые домены соединены гибким, обладающим значительной конформационной свободой участком 37-50.
Белки L7 и L12 идентичны по аминокислотной последовательности, но в белке L7 Н-концевой сериновый остаток ацилирован.
Цель и задачи исследования. Для реаения задачи по введению рпортерннх групп Туг в Н-ковдевую часть белка L7/L12 в гене L7/L12, было решено сделать соответствующие замены методом целенаправленного мутагенеза на фаге U13mpl8. Необходимо было прове-
рить мутантные гены на наличие нужных мутаций с помощью Dot-blot гибридизации и сиквенса, переклонирсвать в экспрессирумций вектор рКК223-3, получить экспрессию мутантних белков в клетках E.coli и разработать методики для выделения белков I7/L12.
Мутантные белки планировали исследовать методами Н-ЯМР. флуоресцентной спектроскопии, спектроскопии кругового дихроизма, микрокалориметрии, а также испробовать на функционирование в синтезе poly(Phe) на poly(U) матрице на рибосомах для того, чтобы отобрать мутантный белок, обладающий структурой, наименее искаженной по сравнению со структурой интактного белка L7/L12.
Научная новизна работы. Показана целесообразность включения продных аминокислот-хромофоров в белки генно-инженерными способами для исследования интактной структуры белков физическими методами. Впервые исследовано окружение вставленных таким образом хромофоров в белке 17/Ы2. Обнаружены рН-индуцируемые конформационные переходы в L7/L12 и исследована тепловая стабильность мутантных белков в широком интервале рН.
Практическая значимость работы. Разработанный метод включения природных аминокислот-хромофоров в белках генно-инженерными методами и отбор мутантов с неискаженной нативной структурой для исследования структуры белков физическими методами является очень удачным решением для исследования структуры белков, в которых отсуствуют природные аминокислоты-репортеры и может быть исспользован для исследования структуры других белков.
Апробация работы. Результаты исследований докладывались на XII Научной конференции болгарских аспирантов в СССР с международном участием (Москва 1990 г.)
Публикации. По материалоь! диссертации опубликовано 3 печатных работ, одни тезисы и одна в приготовлении.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на
страницах, включает 1 таблицу, рисунков и состоит из введе
ния, обзора литературы, описания материалов и методов, результа
тов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы.