Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы
I. Депо-формы модифицированных нуклеозидов - ингибиторов репликации ВИЧ 12
Производные цикло 5 '-О-карбоксикислот 13
Производные бщиюишкарбоксикисяоты A.ZT 13
Производные L-аминокислот 16
5'-0-производные на основе алифатических жирных кислот 17
5'-0-(о>гидроксиалкил) производные AZT и ЗТС 21
II. Модифицированные по фосфатному остатку аналоги нуклеотидов как депо формы
аналогов нуклеозидов и соответствующих 5'-монофосфатов 25
Депо-формы AZTMP с транспортерными заместителями 27
Коньюгаты аналогов dNMP на основе эфиров жирных кислот 28
Депо-формы на основе PFA-коныогатов 31
Депо-формы на основе фосфодиамидов 34
Депо-формы на основе фосфотриэфиров 35
Депо-формы на основе фосфоамидатов 36
5'-Н-фосфопаты модифицированных нуклеозидов 39
5'-Р-фосфат AZT 41
Депо-формы FLT 42
Депо-формы нуклеотидов на основе bis-POM и анаяогжиышаскирующж групп 44
Депо-формы на основе тыазсшещеиных маскирующих групп 46
Депо-формы на основе артоксифосфосшидатов (РРА) 50
Депо-формы на основе циклосшшгениловых (сус1о&з.\) производных 54
III. Депо-формы фосфонатных аналогов ациклических нуклеозидов 56
Депо-форма РМЕА на основе моно- иди-(алкил- и арил-)эфиров 58
Депо-формы ациклических нуклеотидов на основе bis (РОМ) и bis(POC) производных 59
РРА депо-формы ациклических нуклеотидов 61
Bis (SATE) депо-формы ациклических аналогов гуанозина 63
CycloSal депо-формы ациклических аналогов гуанозина 65
РРА- производные 65
Депо-формы АСУ на основе фосфолипидов 65
Депо-формы GCV 67
V. Пути метаболизма депо-форм модифицированных нуклеозидов и нуклеотидов 68
Материалы и методы
Реактивы и препараты 79
Клеточные культур 79
Приборы и методы анализа 80
Определения гидролитической стабильности 82
Изучение метаболизма [б-' Щ-lipAZTи [6- HJ-AZT на культуре клеток 84
Изучение метаболизма [8- flj-HpАСУ на культуре клеток 85
Изучение превращений TEDU и его производных в культуре клеток 86
Изучение накопления и превращения [б- H]-HpAZT и 6-Щ-А2Т на животных 86
Превращение производных TEDIJ в органах мыши 88
Статистическая обработка результатов измерений 88
Результаты и обсуждение
I. Стабильность и превращения HpAZT 89
Стабильность [6-HJ-HpAZTePBS, сыворотке крови человека, кулътураяьиой среде, лизате клеток и гомогенате печени мышей 91
Метаболизм [6-3H]-HpAZT в культуре клеток HL-60 93
Определение кинетических параметров реакции гидролиза
HpAZT и AZTMP катализируемого 5 '-нуклеотидазой 95
Превращения [6- Щ-lipAZT в крови и органах мыши 96
Превращения HpAZT в крови кролика ] 04
II. Стабильность и метаболизм фосфонатных эфиров АСV 107
Определение антивирусной активности, гидролитической стабильности и направления химического и ферментативного гидролиза 108
Метаболизм [8-3Н]-НрАСУв культуре клеток Ve.ro 115
Определение кинетических параметров реакции гидролиза ACVMP и HpACV, катализируемого 5 'нуклеотидазой 117
III. Метаболизм 5 '-фосфатных производных 4'-тио-5-зтил-2'-дезоксиуридшіа 118
Антивирусная активность, стабильность и возможные пути метаболизма 4'-тио-5-этил-2'-дезоксиуридина и его эфиров 119
Метаболизм 5 '-этоксикарбоиилфосфоиата TEDU в культуре клеток Vero, инфицированных HSV-1 123
Превращения 5 '-этоксикарбоиилфосфоиата TEDU in vivo 125
Выводы 128
Список литературы 131
- Производные цикло 5 '-О-карбоксикислот
- Депо-формы AZTMP с транспортерными заместителями
- Депо-форма РМЕА на основе моно- иди-(алкил- и арил-)эфиров
Введение к работе
Актуальность темы и направление исследования. Дизайн антивирусных препаратов основывается на создании соединений, способных воздействовать на различные стадии развития вируса. Основными требованиями являются высокая эффективность, низкая токсичность соединений и медленное развитие резистентности к препарату. Аналоги вуклеозидов играют большую роль в создании препаратов против таких вирусов как вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вирус герпеса (HSV), цитомегаловирус (HCMV) и ряда других. Несмотря на достаточно высокую эффективность препаратов, они имеют ряд существенных недостатков. В частности, наиболее широко используемый для монотералии и в составе "коктейлей" анти-ВИЧ препарат Ретровирт" (3'-азидо-2*,3*-дидезокситимнднн, AZT) имеет достаточно высокую токсичность, проявляющуюся в подавлении функции костного мозга и дисфункции печени, неэффективное прохождение гематоэнцефалического барьера и короткое время жизни в организме, требующее частого введения препарата [Tan X. et al.,1999, Kukhanova MJC et at, 2003]. Развитию ВИЧ-инфекции сопутствует ряд других вирусных заболеваний, в частности, вызываемых вирусами группы герпеса. В настоящее время количество одобренных антигерпетических препаратов весьма ограничено. Широкопрнменяемый анти-HSV препарат Ацшсловир (9-[(2-гидроксизтокси) метил] гуанин, ACV) обладает низкой биодостуггаостью при оральном применении. Кроме того, при длительном применении препаратов развитие инфекдии становится неконтролируемым из-за возникновения резистентных вариантов вируса. Поэтому задача создания новых высокоэффективных и малотоксичных соединений, а также улучшение терапевтических характеристик уже одобренных препаратов весьма актуальна.
Одним из подходов улучшения свойств препаратов является создание их депо-форм. Депо-формы - это фармакологически неактивные соединения, претерпевающие после проникновения в клетки химическую или ферментативную трансформацию с образованием фармакологически активной формы. Депо-формы аналогов нуклеозидов должны иметь высокую антивирусную активность и низкую токсичность, улучшенные биодоступность и фармакокинетические характеристики, а также пролонгированное действие по сравнению с соответствующими аналогами нуклеозидов. Необходимым этапом в изучении потенциальных антивирусных препаратов является изучение их метаболизма.
Изучение метаболизма депо-форм препаратов включает определение химической стабильности и направления гидролиза в различных биологических средах. Исследование динамики накопления и превращения соединений в клеточных культурах и на животных моделях, идентификацию метаболитов и ферментов, участвующих в метаболизме.
4 Цель п задачи исследования. Целями и задачами исследований являлись 1) изучение превращений анти-ВИЧ препарата 5'-Н-фосфоната AZT (Никавир, HpAZT) в культуре клеток и на животных моделях; 2) изучение распределения продуктов метаболизма HpAZT в крови и органах животных; 3) изучение проникновения в клетки Н-фосфоната ACV (HpACV) и определение стабильности и возможных путей превращения HpACV и фосфонатных эфиров ацикловира; 4) определение стабильности и возможных путей превращения 5*-фосфатньгх производных 4-тио-5-зтил-2'-дезоксиуридина (TEDU), проявляющего антигерпетическую активность.
Научная новизна и практическая ценность. Впервые детально изучены превращения HpAZT с применением радиоактивно меченого препарата. Определена динамика накопления метаболитов в крови и органах животных при введении HpAZT или AZT. Показано, что низкая токсичность HpAZT по сравнению с AZT объясняется медленным проникновением препарата в клетки и пониженным содержанием его монофосфата. Показана разница в распределении в крови и органах животных метаболитов, образующихся при введении HpAZT и AZT. Определены кинетические параметры реакций гидролиза HpAZT и HpACV, катализируемого 5'-нуклеотидазой. Показано, что активность фосфонатных эфиров антигерпетических препаратов, явлющихся депо-формами ACV и TEDU, зависит от скорости их гидролиза в различных биологических средах. Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на XII международной конференции "Chemistry of Nucleic Acid Components" (Spindlerav Mlyn, Чехия, 2002), на международных конференциях молодых ученых «Молекулярная биология и генетика» (Киев, Украина, 2001 и 2003 гг.).
Публикации. Основные результаты диссертации опубликованы в 8 работах Структура и объем работы. Диссертация изложена на ... стр., содержит ... схемы, ... таблиц, ... рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, представления полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы ( ... ссылок на литературные источники).
Производные цикло 5 '-О-карбоксикислот
Большинство опубликованных в литературе работ посвящено созданию депо-форм AZT, первому анти-ВИЧ препарату, одобренному в США для лечения ВИЧ-инфекции. Это связано, во-первых, с тем, что, несмотря на выраженную токсичность, AZT остается наиболее применяемым препаратом для лечения ВИЧ-инфицированных людей и входит как обязательный компонент в составе "коктейлей". Во-вторых, время выведения препарата из организма составляет около одного часа, что вызывает необходимость частого приема лекарства. Улучшение характеристик препарата, а именно: понижение токсичности и увеличение времени жизни препарата в организме является актуальной задачей, Этерификация 5 -окси-группы AZT один из методов увеличения биодоступности препарата, увеличения времени жизни в организме и улучшение фармакологических свойств по сравнению с AZT [8]. Далее будут рассмотрены наиболее перспективные в плане создания на их основе лекарственных препаратов депо формы AZT, йцТ и FLT. Производные 5 -0-карбоксюфиров AZT, d/T, FLT.
Описанные в литературе депо-формы AZT, сЦТ, FLT включают Пр карбоксикислоты, 1-адаманташгарбокеикислоту, производные бицикламкарбоксикислоты, О-ацетилсалициловую кислоту и производные полисахаридов; производные L-аминокислот, 1,4-дигидро-1-метил-3-пиридинилкарбоксикислоты, аналоги алифатических жирных кислот, не содержащие гетероатоми (стеариновая кислота) или содержащие гетероатомы (миристиловая кислота); аналоги ненасыщенных жирных кислот, содержащие углеводородные линкеры (ретиноловая кислота); производные 5 -0-(ш-гидроксиалкил) и ряд других [14, 15].
class2 Модифицированные по фосфатному остатку аналоги нуклеотидов как депо формы
аналогов нуклеозидов и соответствующих 5'-монофосфатов class2
Депо-формы AZTMP с транспортерными заместителями
Гликозилированные фосфодиэфиры (2.2) и (2.3) были синтезированы как маскированные депо-формы AZTMP, обеспечивающие проникновение AZT/AZTMP в мозг. При пероральном введении мышам соединения (2.2) основным продуктом метаболизма, определяемым в плазме крови, был AZT, в небольших количествах был идентифицирован AZTMP. При введении (2.3) в плазме в основном детектировался AZTMP. В мозге при введении как (2.2), так и (2.3) главным продуктом был AZTMP. Содержание AZT и его фосфорилированных продуктов в плазме сравнимо с их концентрацией после введение эквимолярного количества AZT. В тоже время, в мозге концентрация AZTMP для соединения (2.2) была в 10 раз, а для (2.3) в 100 раз выше, чем для AZT. Следует отметить, что при введении соединения (2.3) препарат не детектировался ни в плазме, ни в мозге. Однако в мозге в следовых количествах обнаруживался диэфир (2.2), что свидетельствует о быстрой биотрансформации. Таким образом, (2.3) отвечает двум предъявляемым к маскированным депо-формам требованиям - частичной конверсии до AZTMP и способности преодолевать гематознцефалический барьер.
Депо-форма РМЕА на основе моно- иди-(алкил- и арил-)эфиров
При инкубации 3-Me-cyc/oSa/-AZTMP в культуре клеток СЕМ максимум накопления AZTMP и AZTTP наблюдался через 24 часа после введения, а после введении AZT — через 6 часов. Т.е. ТК-зависимое фосфорилирование AZT до AZTMP в клетках происходит значительно быстрее, чем высвобождение AZTMP из cyclo Sal -AZTMP, происходящее в результате двуступенчатого гидролиза. Количество AZTTP, индуцированное cyclo Sal- AZTMP существенно ниже, чем уровень AZTTP, образующийся после введения AZT. В отличие or cvc/oSald-J MP, промежуточный метаболит (бензилфосфодиэфир AZTMP) не определяется в сколько-нибудь значительных количествах, т.е. превращение этого интермедиата происходит очень быстро и не является лимитирующей стадией. Среди продуктов гидролиза eyc/oSal-AZTMP наблюдается существенное количество AZT. Низкий уровень образующихся AZTMP и AZTTP в культуре клеток СЕМ ТКГ коррелирует с низкой активностью eyelo Sal-AZTMP в СЕМ ТКГ, инфицированных ВИЧ-2, в отличие от cycfoSalcUTMP [112]. Данная депо-форма не обладала преимуществом по сравнению с AZT (табл. 10) при испытаниях на культуре клеток. Однако на животных моделях различная фармакокинетика соединений может дать преимущество cyclo Sal- AZTMP по сравнению с AZT.
