Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

"Простые" последовательности в геноме крысы, комплементарные ДНК аденовируса человека типа 5 Иванова Марите Николаевна

<
>

Данный автореферат диссертации должен поступить в библиотеки в ближайшее время
Уведомить о поступлении

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - 240 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Иванова Марите Николаевна. "Простые" последовательности в геноме крысы, комплементарные ДНК аденовируса человека типа 5 : ил РГБ ОД 61:85-2/54

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА I. "Простые" последовательности в геноме эукариот 9

1.1. Повторяющиеся последовательности ДНК в геноме. эукариот

1.2. Сателлитные ДНК (стДНК) 12

1.3. Полипиримидиновые-полипуриновые последовательности ДНК, их возможные функции 17

1.4. Присутствие "простых" последовательностей на концах линейных молекул экстрахромосомалышх рибосомных ДНК (рДНК) 21

1.5. "Простые" последовательности ДНК и транспозиция генов 23

1.6. Возможное участие "простых" последовательностей ДНК в процессах поддержания гомогенности структуры муль-тигенных семейств 25

1.7. Способность некоторых "простых" последовательностей к переходу в Z -конформацию ДНК 30

1.8. "Простые" повторяющиеся последовательности, входящие в состав генов, кодирующих фибриллярные белки 32

1.9. "Простые" последовательности в геноме вируса Эпштейн- Барра 34

ГЛАВА II. Интеграция аденовирусной днк в геном клетки-хозяина.Экспериментальная часть 46

ГЛАВА III. Материалы и методы 47

III.1. Выращивание рекомбинантных фагов Харон 4А, содержащих библиотеку генов крысы, и иммобилизация фаговой ДНК на нитроцеллюлозные фильтры 47

III.2. Получение препаратов ДНК, меченых методом "смещение одноцепочечных разрывов" 48

III.3. Гибридизация ДНК, иммобилизованной на нитроцеллюлоз-ных фильтрах, с мечеными пробами ДНК 48

III.4. Радиоавтография 49

III.4.1. Анализ гибридизационных фильтров 49

III.4.2. Анализ полиакриламидных гелей 50

III.5. Отбор индивидуальных клонов из библиотеки генов крысы, гибридизущихся с ДНК аденовируса типа 5 50

III.6. Выделение ДНК из рекомбинантных фаговых клонов .51

III.7. Выделение и очистка плазмидной ДНК 53

III.7.1. Выделение плазмидной ДНК в препаративных количествах 53

III.7.2. Очистка плазмидной ДНК гель-фильтрацией на колонке биогеля А 15м 55

III.7.3. Центрифугирование плазмидной ДНК в градиенте плотности хлористого цезия 55

III.7.4. Выделение плазмидной ДНК в аналитических количествах 56

III.8. Обработка ДНК рестрикционными эндонуклеазами 56

III.9. Разделение фрагментов ДНК электрофорезом в агароз-ных и полиакриламидных гелях 57

III.10.Зйектроэлюция фрагментов ДНК из агарозных и поли акриламидных гелей 58

III.11.Перенос фрагментов ДНК из агарозного геля на нит- роцеллюлозные фильтры 59

III.12. Субклонирование фрагментов ДНК крысы в плазмидном векторе 60

III.12.1. Получение векторной ДНК 60

III.12.2. Реакция лигирования 60

III.12.3. Приготовление компетентных клеток Е.СОІІ и их трансформация плазмидной ДНК 61

III.12.4. Отбор рекомбинантных клонов 62

III. 13. Определение первичной структуры ДНК 63

III. 13.1. Дефосфорилирование фрагментов ДНК 63

III.13.2. Введение 5'-концевой метки в ДНК 64

III.13.3. Введение 3'- концевой метки в ДНК 64

III.13.4. Получение фрагментов ДНК, меченых по одному концу 65

III. 13.5. Зілюция меченых фрагментов ДНК из ПААГ 65

III.13.6. Частичная химическая модификация меченых по

одному концу фрагментов ДНК 66

III. 13.7. Разделение продуктов частичной химической моди

фикации меченых фрагментов ДНК в ПААГе в денату

рирующих условиях 69

III. 14. Анализ первичной структуры ДНК с помощью ЭВМ .70

III.15. Реактивы и материалы, использованные в работе...70

ГЛАВА ІV. Результаты 72

ІV.І. Получение клонов из библиотеки генов крысы, гибридизующихся с ДНК аденовируса типа 5 72

ІV.2. Картирование и определение первичной структуры фрагментов ДНК, гибридизующихся с ДНК Ад5 75

ІV.З. Выяснение локализации участков генома аденовируса типа 5, комплементарных ДНК рекомбинантных клонов ..85

ІV.4. Выяснение частоты встречаемости в геноме крысы "простых"последовательностей, комплементарных ДНК Ад5...88

Обсуждение результатов 93

Выводы 111

Список литературы 112

Введение к работе

Большую роль в выяснении организации и экспрессии эукариоти-ческого генома сыграло использование в качестве моделей ДНК-содер-жащих вирусов животных, в том числе аденовирусов.К аденовирусной модели часто обращались при исследовании таких фундаментальных процессов, как сплайсинг,механизмы репликации ДНК,структура и функции промоторов и др.Кроме того,аденовирусы обладают способностью к злокачественной трансформации клеток и поэтому эта модель имеет также большое значение для выяснения механизмов канцерогенеза.Трансформирующие свойства аденовирусов тесно связаны со способностью вирусной ДНК или ее сегментов встраиваться в клеточную хромоеому.Механизмы интеграции ДНК пока мало изучены. С другой стороны,выяснение закономерностей интеграции чужеродной ДНК в эукарнотический геном в настоящее время приобрело особую актуальность в связи с развитием методов генетической инженерии, которые позволили проклонировать целый ряд генов; логическим продолжением этих работ являетсяразработка способов введения клонированных генов в.геном клетки,что позволит преодолеть ряд наследственных дефектов, а также сообщить клетке новые полезные свойства.

Для этой цели аденовирусы опять могут оказаться весьма полезными, поскольку можно надеяться, что выяснение закономерностей интеграции аденовирусной ДНК сможет создать предпосылки для конструирования на основе ДНК аденовирусов интеграционных- векторов.

Заманчивым объяснением специфичности интеграции аденовирусной -ДНК является предположение о наличии участков гомологии между, вирусной и клеточной ДНК.В последнее время появились работы,в которых установлено наличие очень коротких участков гомологии на стыке интегрированной вирусной и клеточной ДНК (подробнее см.Обзор литературы, гл. П). В лаборатории биосинтеза нуклеиновых кислот. Института молекулярной биологии АН СССР Е.И. Фроловой и Г.П.Георгиевым /II,

78/ было обнаружено, что ДНК аденовируса.человека типа 5 (Дц5) гиб-ридизуется с ДНК нормальных клеток крысы. Эти работы явились предпосылкой для наших исследований. Целью работы было установление характера гомологии между ДНК Дц5 и ДНК крысы. Для осуществления этой цели предстояло: I) выделить из библиотеки генов крысы, построенной на основе фага Харон 4А, клоны, гибридизующиеся с ДНК. Дц5; 2) выделить из этих клонов минимальные сегменты гомологии и субклонировать их в плазмидном векторе; 3) составить подробные ре-стриктные карты областей гомологии, а также определить их первичную структуру; 4) провести определение участков генома Дц5, гомологичных проклонированным сегментам генома крысы; 5) провести анализ полученных первичных структур и сравнить их с известной структурой гомологичных областей генома Дц5; Б) выявить частоту ветре-, чаемости в геноме крысы последовательностей, гомологичных ДНК Ад5. В ходе работы было установлено, что проклонированные участки генома крысы, гибридизующиеся с ДНК Дд5, относятся к типу "простых" повторяющихся последовательностей..Данные типы "простых" последовательностей были выявлены впервые. Выделенные сегменты "простых" повторов ДНК.крысы были весьма протяженны и составили до-800 пар нуклеотидов (п.н.). Большинство до сих пор выявленных "простых" последовательностей в геноме эукариот имело значительно меньшую протяженность. В геноме аденовируса обнаружены аналогичные структуры, однако меньшего размера. В геноме крысы содержится несколько сотен участков, в которых расположены "простые" последовательности выявленных наїли типов. Весьма возможно, что обнаруженные нагли "простые" последовательности генома крысы, комплементарные ДНК аденовируса, могут служить своеобразными мишенями для интеграции вирусной ДНК в геноме клетки.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА I. "ПРОСТЫЕ" ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ В ГЕНОМЕ ЭУКАРИОТ

1.1« Повторяющиеся последовательности ДНК в геноме эукариот

15 лет тому назад Britten и Kohne/40/ показали, что ДНК эукариот наряду с уникальными последовательностями ДНК (приблизительно одна копия на гаплоидный геном) содержит значительное количество повторяющихся последовательностей. Их можно класси-фицировать как умеренно повторяющиеся (10-10 копий на гапло-идный геном) и высоко повторяющиеся (10 копий на гаплоидный геном). Повторяющиеся последовательности ДНК обнаружены у всех эу-кариотов (и даже у архабактерий /175/). Низшие эукариоты, как, например, дрожжи содержат их меньше, чем высшие организмы, где они могут составлять даже 80$ всего генома /205/.

Уникальная ДНК обычно состоит из последовательностей, которые непосредственно кодируют белки, хотя некоторые гены также представлены в гаплоидном геноме несколькими копиями, и поэтому относятся к повторяющимся последовательностям /49/.

Часть повторяющихся последовательностей организована в тан-демно повторяющиеся блоки, а другие рассеяны по всему геному. Сателлитные ДНК и некоторые семейства повторяющихся генов (гис-тоновые, глобиновые, иммуноглобулиновые гены; гены, кодирующие транспортные и рибосомалыше РНК и др.) представляют собой примеры такой организации.

Часто повторяющиеся последовательности ДНК или сателлитные ДНК состоят из тандемных повторов относительно коротких блоков (5-Ю пар нуклеотидов /п.н./). Эти последовательности не транскрибируются и в основном локализованы в конститутивном гетеро-

хроматине, который располагается в центромерных и теломерных областях хромосом; их функция пока не понятна. Вероятно, они выполняют структурную роль в организации хромосом и в механике хромосом (конъюгации, рекомбинации и др.) /119/.

Умеренно повторяющиеся последовательности ДНК можно разделить на две категории: длинные и короткие. Они рассеяны по всему геному между уникальными последовательностями и варьируют по длине от 150-300 п.н. до нескольких тысяч пар нуклеотидов.

Длинные повторы, по-видимому, представляют собой самостоятельный класс повторяющихся последовательностей, то есть они не состоят из тех же последовательностей, что и короткие повторы. Такие транскрибируемые повторы имеют длину 4-7 тыс. п.н. /117, 76/. Неожиданным оказался тот факт, что в политенных хромосомах дрозофилы разных линий многие места локализации данной повторяющейся последовательности были различными /117,225/. Таким образом эти последовательности не имеют фиксированной локализации в геноме, поэтому они были обозначены как мобильные диспергированные гены (МЖ). Интересно отметить, что МЖ имеют очень большое сходство с провирусами эндогенных ретровирусов /199,86/. Высказывается даже гипотеза о том, что ретровирусы произошли в филогенезе из ІДДГ /199/.

Короткие рассеянные повторяющиеся последовательности ДНК можно разделить на несколько семейств с разным числом отдельных

представителей. Некоторые семейства содержат больше чем 5x10 представителей, в то время как другие - только несколько. При этом отдельные представители одного семейства имеют сходную, но не идентичную первичную структуру /119/.

Так, например, из генома человека была выделена и проклони-рована повторяющаяся последовательность ДНК, обозначенная авто-

- II -

рами как Aiu-последовательность /170/. Она представлена в геноме приблизительно 300 тыс. копий и имеет размер 300 п.н. Разные представители Aiu семейства обнаружены вблизи многих структурных генов /22,23,70,77,62,119,128/ и даже в двух интронах онкогена человека /74/. Предполагается, что они составляют часть транскрипционной единицы соответствующих генов. Аналогичные последовательности ДНК обнаружены также в геноме мыши (семейство BI Д35/), обезьяны /93/ и китайского хомячка /100/. Сравнивая первичные структуры Aiu- и В1-последовательностей выявился участок длиной около 55 п.н. с высокой гомологией. Такая консервативность в эволюции этого участка безусловно свидетельствует о функциональной значимости этих последовательностей. BI и Аіи-после-довательности также имеют некоторую гомологию с 7s /216/ и 4,5s /97/ РНК и с районом начала репликации вирусов группы папова /118,5/. Эти наблюдения позволили предположить, что BI- и Aiu-последовательности могут служить началом репликации клеточной ДНК. Большинство разновидностей коротких повторов активно транскрибируются в составе гетероядерных РНК (гяРНК), хотя большая часть транскриптов деградирует в ядре без выхода в цитоплазму /56,136,19/.

На большом числе примеров показано присутствие разных повторяющихся последовательностей вблизи и в интронах активно транскрибирующихся генов. Поэтому предполагается, что они могут контролировать транскрипционную активность прилегающих к ним генов /56/, а в последнее время внимание сосредоточено на их возможной мобильности в геноме /43,133,137,132/.

Кроме вышеописанных сравнительно сложно устроенных повторяющихся последовательностей ДНК, в последнее время довольно часто обнаруживаются повторы с низкой сложностью или так называ-

емые "простые" последовательности ДНК. Подобно сателлитным ДНК, они построены из очень коротких единиц повтора, но в отличие от сателлитов, имеют меньшую длину и обнаруживаются вблизи или в интронах активно транскрибирующихся генов. Высказаны некоторые гипотезы об их возможной роли в регуляции транскрипционной активности прилегающих к ним генов, и особенно, об их участии в процессах рекомбинации и конверсии генов. Поэтому будет целесообразно рассмотреть их более подробно.

Поскольку некоторые "простые" повторяющиеся последовательности построены подобно сателлитным ДНК, остановимся на их характеристике.

1.2. Сателлитные ДНК (стДНК)

В исследованиях по распределению молекул ДНК центрифугированием в градиенте плотности CsCi обнаружено, что у большинства эукариот существуют отдельные компоненты, отличающиеся по содержанию G и с от остальной части ДНК. Эти последовательности состоят из чрезвычайно протяженных блоков высокоповторяющейся ДНК, в которой очень простые последовательности повторяются сотни,если не тысячи раз. Они названы сателлитными ДНК (стДНК) или сателлитами /130/.

При использовании градиента CS2SO4, содержащего ионы Ag+

2+ или Hg , разрешающая способность метода выделения минорных компонентов ДНК возрастала. Плавучая плотность ДНК в градиенте чистого Cs2so4 определяется суммарным нуклеотидным составом, т.е. увеличивается с повышением содержания GC-nap. Введение ионов Hg2+, связывающихся более прочно с ДНК, обогащенной АТ-парами, а ионов Ag+, предпочтительно реагирующих с ДНК G-с типа, дает возможность увеличивать различия в плавучей плотности стДНК /152/. Это позво-

- ІЗ -

ляет выявлять так называемые "скрытые" стДНК. Так, например, при повторном центрифугировании зоны стДНК кенгуровой крысы из нейтрального градиента Csci с плавучей плотности 1,713 г/см3 в градиенте Cs2so4, содержащем Ag+, обнаруживаются две фракции стДНК - HS^ и hSa , которые отличаются по нуклеотидной последовательности еДИНИЦЫ ПОВТОра ^-ТААССС-З1 И 5,-ACACAGGCGGG-3,) и GC-содержанию (43,5 и 66,1$ соответственно /99/).

Важное свойство стДНК - ее вариабельность как по количеству, так и по нуклеотидному составу. Количество стДНК в геномах разных организмов варьирует от I до 80$ всей ДНК /8/. СтДНК имеют широкие вариации нуклеотидной последовательности, некоторые состоят только из А и Т /41,192/, а другие являются GC-богатыми Д7І/.

Многие виды организмов содержат несколько хорошо различаемых сателлитов, которые могут быть родственными другим по нуклеотидной последовательности (например, некоторые стДНК у дрозофилы /82,41/) или совершено различными (у кенгуровой крысы /99/).

Еще до расшифровки нуклеотидной последовательности стДНК эксперименты по реассоциации ДНК показали, что стДНК обладают общим свойством - все они состоят из повторяющихся последовательностей. Судя по скорости реассоциации, можно было заключить, что стДНК имеет сравнительно низкую сложность. Прямым доказательством этого было определение первичной структуры б -сател-литной ДНК морской свинки /183/. Показано, что эта стДНК построена из блоков 5 -СССТАА-3 , которые повторяются в геноме морской свинки миллионы раз.

В последнее время в исследовании стДНК стали широко применяться методы рестрикционного анализа с последующим электрофо-

резом и определением первичной структуры ДНК полученных фрагментов. Этот подход оказался весьма эффективным и позволил обнаружить ряд новых структурных особенностей этих последовательностей. Например, с помощью рестриктного анализа удалось разделить две стДНК дрозофилы, имеющие одинаковую плавучую плотность (1,705 г/см3) и близкую нуклеотидную последовательность (поли /aagag/ и поли/aagagag/) , но различную картину рестрикции рест-рикционной эндонуклеазой Mboil /54/.

У ряда организмов в ДНК с помощью рестриктного анализа обнаружены новые, более сложно организованные стДНК /116,48,51,220, 151,68,169,168/. Такие нетипичные стДНК построены из длинных, близких по первичной структуре мономерных единиц длиной от нескольких десятков до нескольких сотен п.н. Детальное их исследование показало, например, что в геноме человека два рядом расположенных мономера сателлитов размером 170 п.н. отличаются друг от друга значительно больше, чем два рядом лежащих димера по 340 п.н. каждый /220/. На этом основании предполагается двух-этапный процесс эволюции данных частповторяющихся участков: дупликация и дивергенция с последующей амплификацией /182/.

С применением рестриктного анализа удалось выявить еще более сложно организованные стДНК. Например, стДЖ-1 быка состоит из повторяющихся блоков размером 1460 п.н. /168/.

Одной из интересных общих черт многих типичных стДНК является присутствие в каждой цепи двух или трех из четырех возможных нуклеотидов. Значение этого явления пока не выяснено, однако возможно, что такая особенность связана с функциями стДНК или обусловлена закономерностями их возникновения /2/.

Широкие вариации в количестве и нуклеотидной последовательности типичных стДНК свидетельствует о том, что они не уча-

ствуют в кодировании каких-либо определенных белков. На это указывает, во-первых, очень короткая длина входящих в сателлиты блоков повтора, и, во-вторых, отсутствие в них по каждой цепи одного (или двух) из возможных четырех нуклеотидов. Поэтому многие сателлиты могли бы кодировать очень странные белки, а некоторые, содержащие очень много терминирующих кодонов трансляции, вообще не способны кодировать какой-либо белок.

Транскрипционная неактивность стДНК связана с третьим важным их свойством, а именно, местом их нахождения в конститутивном гетерохроматине, поскольку постоянно конденсированный гете-рохроматин всегда транскрипционно инертен. Нельзя сказать, что он не имеет никакой функции. Напротив, конститутивный гетеро-хроматин может иметь влияние на экспрессию генов, которые находятся вблизи от него (эффект позиции),и на процессы, связанные с мейозом /38/. Поскольку стДНК локализована в конститутивном гетерохроматине, предполагается, что их функция связана с функцией гетерохроматина и связывается с конститутивной ролью этих последовательностей в поддерживании целостности хромосом, стабилизации центромер, создании различий в центромерных районах разных хромосом, а также с участием в узнавании гомологичных хромосом при мейозе и в контроле за размерами ядра и клеточного роста /110,38/. Однако пока трудно объяснить, почему у некоторых организмов для выполнения этой функции требуется до половины количества клеточной ДНК, в то время как у других-стДНК - фактически нет /38/.

Britten и Kohrfe/40/ выдвинули предположение о том, что стДНК играет эволюционную роль. Они пришли к выводу, что стДНК была начальным продуктом "скачкообразной" репликации, обусловившим появление избыточной ДНК, которая увеличивает эволюционный потенциал

организма. Таким образом, в результате многочисленных мутаций, транслокаций и рекомбинаций с уникальными последовательностями генома может увеличиваться способность организма формировать новую генетическую информацию. С этой точки зрения интересную структуру представляет собой ДНК колец зшрономуса,активно транскрибирующаяся с образованием высокомолекулярной РНК (75s). Внут-реняя структура кольца Бальбиани - тандеглно расположенные небольшие повторы 54-58 н.п., организованные в небольшие блоки из 3 или 8 членов. Все эти блоки-повторы обладают большой степенью гомологии /44/. Авторы предполагают, что такая транскрибирующая единица возникла из сателлитных последовательностей ДНК.

Согласно гипотезе Britten и Kohne/40/, стДНК по крайней мере на ранних стадиях дивергенции может не нести никакой функции. Таким образом, для того, чтобы стДЖ выполняла какую-либо функцию после дивергенции, она должна сохраняться в геноме весь долгий период эволюции, не испытывая давления отбора для ее сохранения. Действительно, имеется общая тенденция к уменьшению содержания ДНК у организмов, которые произошли от общего предка /2/. Отсюда следует, что давление отбора, приводящее к эволюционной специализации, может вызвать потерю лишней ДНК, хотя неизвестно, как это происходит. Можно предположить, что наличие стДНК связано с какими-то функциями, играющими роль в приобретении организмом селективного преимущества. В поддержку этой точки зрения свидетельствует тот факт, что различные организмы используют разные способы для уменьшения количества (или элиминации) ДНК, которая не требуется для функций соматической клетки. В тех случаях, когда этот вопрос исследовался детально, было показано, что элиминирующаяся ДНК имела характеристики сател-литной ДНК /189/. Таким образом, если бы сателлитная ДНК дейст-

вительно не имела никаких функций, вероятно, должны были бы развиваться способы для ее элиминации. Однако ее сохранение в зародышевых клетках свидетельствует о том, что она несет какие-то функции, связанные с генетическими процессами мейоза /38/.

1.3. Полипиримидиновые-полипуриновые последовательности ДЇЇК, их возможные функции

Последовательности ДНК, подобные сателлитным, обнаружены также в эухроматиновой области хромосом, вблизи от активно транскрибирующихся генов, или в их нитронах.

Например, в одном интроне гена овальбумина X цыплят обнаружен "простой" повтор, в котором 36 раз повторяется последовательность из пяти нуклеотидов З'-тстсс-з* /143/. Этими же авторами показана другая последовательность, состоящая из 27 повторов последовательности 5*-ggaag-3' 2500 п.н. от 5'-начала транскрипции гена овотрансферина цыплят, а также родственная, но несколько иная последовательность в соответствующей области гена овотрансферина фазанов, в которой 5!-ggaaa-3' повторяется 55 раз.

Б геноме мыши тоже обнаружена похожая последовательность вблизи гена иммуноглобулина С^о (26 повторов блока 5i-gaaga-3') /57/. Этот повтор обладает большим сходством с элементом, найденным в интроне гена овальбумина X цыплят (только в другом направлении по отношению к транскрипции). Пока неизвестно, относится ли эта последовательность к повторяющимся последовательностям генома мыши. В геноме человека вблизи псевдогена А-ак-тина обнаружена последовательность, в которой 43 раза повторяется блок 5f-GAAA-3' /149/, при этом данная последовательность относится к высокоповторяющимся последовательностям генома человека. В интронах различных областей иммуноглобулиновых генов раз-

ных представителей эукариот также обнаружен целый ряд "простых" последовательностей, состоящих из полипиримидиновых-полипурино-

ВЫХ бЛОКОВ, Например: (5'-GGAGA-3f)24» (5f-GGGAGA-3f)l2»

(5»~ga-3') /164,124/. Все эти последовательности характеризуются тотальной асимметрией расположения оснований: пуринов - по одной, а пиримидинов - по другой цепи. Такие регулярно построенные полипиримидин-полипуриновые блоки имеют большое сходство с сатиляитными ДНК, которые показаны в геноме дрозофилы (поли

(AAGAG) и nOOT(AAGAGAG) /82/), ТОЛЬКО ВЫШеОПИСаННЫе ЭЛемеНТЫ

короче. На примере этих "простых" повторяющихся последовательностей у птиц авторами предполагается /143/, что некоторые или даже все эти элементы могут быть организованы в более протяженные повторы в неактивной области генома, и соответствуют множественным сателлитным компонентам, которые выделены из кур и многих других птиц с помощью центрифугирования суммарной ДНК в градиентах плотности CsCi /52/. Как это показано для более сложных высокоповторяющихся последовательностей (например, <ХШ-пов-торы в геноме человека): отдельные их элементы рассеяны между уникальными последовательностями генома, что указывает на некоторую их мобильность в геноме /55/.

Судя по гомологии обнаруженных "простых" последовательностей вблизи генов овотрансферина у фазанов и кур, авторами предполагается, что соответствующие гены сформировались из одного локуса предшественника, а в процессе эволюции и дивергенции благодаря мутациям могли возникнуть различия между "простыми" повторами. Не исключено, что эти различия могли возникнуть путем независимой амплификации короткой, богатой пуринами последовательности из генома предшественника, если допустить, что первоначальная последовательность служила "горячей точкой" для ампли-

фикации. Исследования соответствующих областей в геномах других птиц могут помочь решению этого вопроса.

Полшшримидиновые блоки длиной от нескольких десятков до нескольких сотен п.н. со случайной или регулярной организацией /основная часть повтора состоит из ()н/ оснований обнаружены в фланкирующих областях или в интронах целого ряда генов цыпленка, кодирующих белки яйца: оватрансферин /143,49/, лизоцим /18/, овальбумин X и У /101,102,103/. Все перечисленные гены экспрес-сируются в яйцеводе под контролем сходных стероидных гормонов /7,35/. Вполне возможно, что вышеописанные повторяющиеся последовательности, благодаря их близкой структуре и месту локализации, принимают участие в регуляции экспрессии соответствующих генов /7,140,181/.

В этом отношении интересные данные получены Dubvig и соавт. /69/ и Johnson и Morgan /120/. Ими показано, что такие полипири-мидиновые-полипуриновые блоки способны образовывать необычные вторичные структуры, характеризующиеся наличием как одноцепочеч-ных участков, так и участков, формирующихся из четырех цепей ДНК.

В ДНК большинства высших организмов содержатся области,обогащенные пуриновими или пиримидиновыми основаниями. Такие области обычно имеют очень небольшие "вкрапления" иных нуклеотидов. В состав полипиримидиновых блоков большей частью входят оба пиримидин овых основания, но иногда такие блоки содержат только одно из оснований, то есть представляют собой гомополимврные последовательности. Методы выделения обогащенных однем типом оснований последовательности ДНК, основанные на хишческой деградации молекул, описаны недавно в обзоре /7/. В последнее время для получения полипиримидиновых блоков стали использовать метод аффинной хроматографии суммарной ДНК на колонках с поли[а(оА)"]-целлюлозой

/29,31/. Количество полипиримидиновых (и соответственно полипу-риновых) блоков в геноме разных организмов варьируют от 0,1 до 10$ всей ДНК /7/. Размеры таких блоков варьируют от нескольких десятков до нескольких сотен п.н. Найдены различные типы расположения полипиримидиновых последовательностей в геномах. Так, у мыши 1,3$ всей ДНК составляют полипиримидиновые зоны длиной 20-200 п.н., которые равномерно распределены по всему геному с ин-тервалами (12-15).10 п.н. /29/. Аналогичное распределение блоков наблюдалось и в геноме человека, но расстояние между блока-ми составляет (20-25)»10 п.н, /32/, Иная организация полипиримидиновых блоков найдена у дрозофилы, пчелы, морского ежа /53/ и кур /17/: блоки расположены вдоль одной цепи ДНК на довольно близком расстоянии друг от друга - приблизительно 1,5 тыс.п.н. Общее число блоков у разных организмов варьирует от 100 до 25000 /7/, причем в геномах высших организмов их намного больше, чем у низших /32/.

Небольшие полипиримидиновые блоки находятся в составе других типов последовательностей. Например, третья часть всех инвертированных повторов крысы (11000) содержит полипиримидиновые участки длиной приблизительно 80 п.н. /197/. Распределение,число и длина блоков отличаются в разных по частоте повторения последовательностях. Среди умеренно повторяющихся последовательностей число полипиримидиновых участков больше, а длина их меньше, чем среди уникальных последовательностей. Предпочтительное расположение полипиримидиновых блоков внутри повторяющихся последовательностей отмечается для ряда объектов /29,31,8,148,143/.

Функциональное назначение таких участков в геноме пока неясно, хотя они, по-видимому, довольно стабильны в эволюции /29, 31/. В районе полипиримидиновых блоков имеется сильная асиммет-

рия по нуклеотидному составу. Это может быть, например, сигналом для связывания РНК-полимераз /8/. Не исключено, что такие блоки могут определять выбор кодирующей цепи ДНК /29/. Области полипи-римидиновых блоков могут служить для терминации транскрипции генов, например, генов, кодирующих транспортные РНК (тРНК) /210,3/. Это следует из того, что все первичные транскрипты генов тРБК эу-кариот имеют на 3'-концах короткие поли(и) последовательности /3/.

В составе гетероядерных РНК (гяРНК) и матричных РНК (мРНК) имеются участки, обогащенные одним из четырех нуклеотидов /42, 197/. Например, в гяРНК крысы обнаружили полипиримидиновые участки, комплементарные полипуриновым последовательностям, находящимся в обращенных повторах /197/. Транскрибируемость полипири-мидиновых и полипуриновых последовательностей дает возможность предполагать их участие в каком-то этапе посттранскрипционного процессинга РНК. Эти последовательности могут использоваться как места связи РНК со специфическими ядерными белками при упаковке ее в рибонуклеопротеид /8/.

1.4. Присутствие "простых" последовательностей на концах линейных молекул экстрахромосо-мальных рибосомных ДНК (рДНК)

У большинства эукариотических организмов рибосомные гены представлены блоком(ами) тандемно повторяющихся копий, локализованных в хромосоме(ах). Однако у некоторых одноклеточных эукари-от значительная часть рибосомных генов обнаружена в виде экстрахромосомных элементов. Например, у тетрахимены, Physarum и слизистых грибов экстрахромосомальные рибосомные ДНК (рДНК) организованы в виде палиндромных линейных молекул, но также небольшая часть молекул имеет кольцевую форму. По концам линейные рДНК мо-

лекулы имеют сателяит;оподобные повторяющиеся структуры, в которых местами встречаются однонитевые участки /33, 121, 72/. Эти последовательности построены из тандемных повторов блоков из 6 или 8 нуклеотидов, при этом у разных вышеуказанных организмов они близки по нуклеотидной последовательности: б'-ССССАА-З' /33, 223, 126/; б'-ССССТА-З' /121/ и б'-ССССАААА-З' /158, 131, 160/. Число блоков варьирует от 20 до 70. Это указывает на то, что "простые" повторы на концах рДНК выполняют одинаковую функцию, т.е. они участвуют в процессе репликации молекул рДНК /202, 45, 222/. Эти последовательности, по-видимому, могут заполнять бреши на б'-концах, образующихся во время репликации линейной молекулы. Блоки таких последовательностей также обнаружены вблизи единственной копии рибосомного гена в хромосоме этих организмов. Предполагается, что в процессе фрагментации генома "простые" повторы служат местами узнавания для вырежания и амплификации геномной копии рДНК /158, 126/.

Несколько иной концевой повтор обнаружен у экстрахромосо-мальной рДНК Mctyostelium discoide.um . Он построен из поли-пиримидиновых блоков (спт)т, где п варьирует от I до 8, a m -от 18 до 34 /72/. Благодаря нерегулярности этого повтора наблюдается некоторая гетерогенность нуклеотидной последовательности и размеров концов разных молекул. Вблизи концевого повтора обнаружен еще один повтор, который состоит из блока размером 29 п.н., повторяющегося 4 раза, причем каждый блок начи-начется и кончается прямым повтором из пяти нуклеотидов (5'-gatga-3'). Функция этой последовательности неясна.

Экстрахромосомальная рДНК Dictyostelium discoideum ре-

плицируется исключительно автономно, т.е. ни в одном цикле жиз-

ни этого организма не обнаружено, что происходила бы амплификация рДНК с геномной копии рибосомного гена или его вырезание из хромосомы, поэтому кажется вероятным, что данный концевой повтор функционирует как праймер при репликации отстающей цепи линейной молекулы рДНК и обеспечивает полную репликацию всей молекулы. Авторы также предполагают, что повтор (спт)га может способствовать рекомбинации между линейными молекулами экстрахро-мосомальной рДЖ. Авторы отмечают, что гетерогенность концов разных молекул рДНК этого организма находится в контрасте с гомогенностью самой рДНК. Если бы удалось обнаружить, что экстра-хромое ома льная рДЖ когда-либо амплифицируется или вырезается из генома, то это привело бы к существованию другого механизма, делающего всю популяцию автономно реплицирующихся молекул гомогенной.

1.5. "Простые" последовательности ДЖ и транспозиция генов

В блоке гистоновых генов морского ежа обнаружены участки, чувствительные к нуклеазе s1 /107/. Эти участки расположены в спейсере между генами гистонов Н2А и HI, а также во фланкирующей области к гену гистона HI (см. рис. I).

Клонирование и определение первичной структуры этих областей показало, что чувствительные к нуклеазе s1 участки расположены внутри "простых",тандемно повторяющихся последовательностей B^(a)-5t-(CA)W'(GT)22-V и S1 (ъ)-5^^)^-31. Сходные "простые" последовательности найдены также вблизи гистоновых

Н1

S.,(a)

S^b)

Рис, I. Строение одного гистонового оперона морского ежа Д07/

генов в ДНК других организмов /127,194,108/.

Гистоновые гены обычно сгруппированы в тандемных повторах. Число копий генов, порядок и ориентация широко варьируют в геномах разных организмов, а в некоторых случаях даже в одном геноме /127/. В геноме таких организмов, которые содержат значительное количество гистоновых генов (например, дрозофила, морской еж), они расположены в тандемно повторяющихся блоках, но обнаружены также "одинокие" гены /46/. При этом субтипы гена НІ встречаются с наибольшей частотой. Все эти факты позволяют думать, что существует механизм, с помощью которого осуществляется независимое перемещение, репликация и дивергенция случайных "одиноких" гистоновых генов (главным образом гена Ш). Автор предполагает возможное участие этих "простых" последовательностей в таком механизме, где они могут служить "горячими точками" для случайной рекомбинации с другими областями ДНК той или другой хромосомы, если она содержит аналогичный повтор /107/.

1.6. Возможное участие "простых" последовательностей ДНК в процессах поддержания гомогенности структуры мультигенных семейств

Многочисленные исследования разных генов семейства иммуноглобулинов и областей, окружающих эти гены, также выявили большое количество элементов "простых" последовательностей.

Молекула иммуноглобулинов (ИГ) класса G, представляющая собой типичное антитело, построена из пары одинаковых тяжелых и легких цепей. Подобный субъединичный состав имеют молекулы ИГ и других классов. Оба вида цепей, в свою очередь, включают домены, гомологичные по аминокислотной последовательности, свернутые в компактную и стабильную глобулу, которые представляют собой функционально специализированные полипептидные участки. ИГ выполняют две главные функции: распознавание чужеродных веществ (функция связывания антигена) и элиминацию, или разрушение,этих чужеродных веществ (комплексная эффекторная функция). Функциональная двойственность молекулы ИГ отражена в строении ее полипептидных цепей. Характеризующийся очень большой изменчивостью структуры и-концевой домен каждой цепи называется вариабельным (V-домен). Этот домен вместе с прилегающей к нему альтернативной цепью образует активный центр антитела, который выполняет функцию связывания антигена. Остальная часть цепей, представленная одним доменом в легких и несколькими в тяжелых цепях,называется константной (С) областью. Она выполняет общие эффектор-ные функции - например, связывание комплемента и фиксацию на клеточной мембране, и поэтому ее структура постоянна или малоизменчива в пределах каждого класса у данного вида организма /I/. Существование разнообразия классов и подклассов С-областей не имеет прямого отношения к специфичности активного центра ИГ, а

~ 26 -

связано с их дифференциацией по эффекторной функции. Следовательно, для обеспечения надежного иммунитета к огромному разно-образию антигенов экзо- и эндогенного происхождения организм должен быть способен произвести соответствующее огромное число вариантов активных центров ИГ. Для обеспечения этого феномена высказаны различные предположения: первое, вся система ИГ генов полностью закодирована в зародышах и передается из поколения в поколение /178,163,88/. Второе, - эти гены достигают максимальной вариабельности благодаря соматическим мутациям и рекомбинациям /ИЗ/. На основе полученных многочисленных данных в настоящее время ни одна из существующих теорий, объясняющих причины структурного разнообразия молекул антител, не может быть ни окончательно признана, ни отвергнута, а сейчас кажется вероятным,что окончательное объяснение будет объединять в себе элементы обеих гипотез /20/. А именно: множество и разнообразие ИГ генов достигаются благодаря соединениям сегментов зародышевых генов в различных комбинациях /71,36,114/, пластичности районов соединения /71,144/ и соматическим мутациям /114,54,39,129/.

Показано, что в вариабельной области ИГ генов могут происходить точечные мутации, небольшие делеции,. замены оснований,которые могут приводить к образованию терминирующих кодонов, что является критическим для сохранения последовательности полипептидов /54,39,27,134,88,219/. Очевидно, необходимость дивергенции вариабельной области ИГ генов допускает нежелательные мутации, даже если они могут приводить к инактивации некоторых генов (они становятся псевдогенами) и при этом уменьшается их множество /20,21/.

Те же самые проблемы появляются и других семействах тандем-но повторяющихся генов (например, гены гистонов /127/, глобинов

/161/, гены, кодирующие рибосомные /148/ и транспортные /75/ РНК и др.). Поэтому возникает вопрос: каким же образом мультигенные семейства сохраняют свою общую гомогенность? Можно предполагать существование механизмов коррекции, которые предотвращали такие явления, как случайные неравные кроссинговеры и мутации в кодирующих областях генов /217/.

Еще в 1976 году Smith /182/ выдвинул гипотезы о том, что повторяющиеся последовательности могут сохранять гомогенность, если их повергнуть быстрой коррекции или амплификации с помощью неравного кроссинговера. Хотя эта гипотеза и может объяснять как гомогенность сателлитных ДНК, так и их быструю дивергенцию, она не может легко объяснять гомогенность сложных тандемов генов.

Для коррекции генов предложено два механизма: неравный крое-синговер /III/ и конверсия генов /181,20/. В обоих механизмах большое внимание сосредоточено на гомологичных фланкирующих областях генов, которые могут увеличивать возможности рекомбинаций. Дополнительные сигналы, такие, как повторы "простых" последовательностей могут повлиять на коррекцию генов, функционируя как "горячие точки" рекомбинации /127,181,21,50,114/.

Механизм, позволяющий объяснить это явление, предложен Kedes /127/.

На примере трех блоков повтора гистоновых генов, у которых в гомологичных спейсерных областях в аналогичной позиции расположены повторы "простых" последовательностей, Kedes предполагает, что если рекомбинация зависит от скорости образования комплементарных пар оснований, то эта "простая" последовательность будет восстанавливаться гораздо быстрее, чем остальной сегмент гистоновых генов. При этом последующая миграция разветвления далее восстанавливает всю единицу повтора в точном порядке. Таким

образом, такая застежка-"молния" ("zipper") может уменьшать вероятность рекомбинации со случайной, но похожей областью ДНК. Решающее значение при этом имеет несколько сниженная скорость ре-ассоциации в результате неправильного спаривания оснований, и молекулы с неполной гомологией так и не успевают сформироваться из-за быстрой реассоциации гомологичных последовательностей Л27/. Благодаря этим "zipper" или "z-элементам" может повышаться возможность рекомбинации между гомологичными генами, действуя как механизм коррекции генов и уменьшая случайные рекомбинации.

Данный механизм хорошо иллюстрируется на следующем примере. При исследованиях сегмента ДНК мыши длиной 4 тыс. п.н., в котором расположено 5 генов вариабельной области тяжелой цепи имму-глобулинов, установлено, что кодирующие области имеют больше 75$-гомологии, а фланкирующие - несколько ниже. На расстоянии приблизительно 380 п.н. от начала транскрипции этих генов обнаружены "простые" повторяющиеся последовательности, построенные из повторов б'-ТСС-З' и б'-ТСА-з' /50/. У двух из этих пяти генов в более дистальной части фланкирующих областей ДНК в 5'-направлении от "простого" повтора выявляется меньшая гомология; при этом у них "простая" последовательность отличается от остальных трех генов мозаичным строением обоих блоков повтора (у трех генов "простые" последовательности организованы в форме s'-dcOn (тсА)т-з*). На основании вышеописанных данных авторы предполагают, что эти гены произошли путем дупликации общего предшественника и, судя по степени дивергенции (18$), разделились сравнительно давно. Обсуждая проблему гомогенности этого длинного участка из 5 генов (с высокой степенью гомологии), авторы предполагают участие каких-то дополнительных факторов, кроме тех,

которые влияют на экспрессию генов, поскольку сохранение гомологии в фланкирующих областях генов может привести к селективным взаимодействиям родственных генов, важных для сохранения этих семейств генов в эволюции. Эти взаимодействия могут начинаться в повторах "простых" последовательностей с последующей гомологичной рекомбинацией между двумя генами и привести к перестройке соответствующих генов. Гены одного подкласса, благодаря аналогичному "простому" повтору могут легко рекомбинировать между собой. Взаимодействия между разными подклассами происходит намного реже, но тем не менее это не исключено (например, вышеописанные "одинокие" гистоновые гены). Существование в фланкирующих областях разных "простых" последовательностей, возможно,указывает на их различную рекомбинационную способность /50/.

Несколько более сложно организованные "простые" повторяющиеся последовательности найдены в областях иммуноглобулиновых генов, где происходит переключение разных классов константной области тяжелых цепей ИГ генов. Эти области названы s-элементами /124/. Ранее было показано, что в геноме мыши в s^ области расположен тандемный повтор из 49 п.н. /125/, а в s^ области - повтор из 80 п.н. /57,157/. В разных областях sи , s*,, s^ обна-руженц последовательности длиной в 20-30 п.н., построенные из двух единиц повтора: S'-gagct^' и S'-ggggt^* /153,92/. Авторы предполагают, что благодаря этим элементам и происходит рекомбинация, которая приводит к функциональному переключению определенной области. Но поскольку последовательности повтора в случаях разных пар константных сегментов могут различаться, то можно предполагать участие специальных ферментов /153/.

Сходные "простые" повторяющиеся последовательности обнаружены и в ДНК других семейств тандемно повторяющихся генов, где

- зо -

они также расположены в фланкирующихся областях или в интронах: повторы (TG)n и (ст)п у гистоновых генов /194/, (TG)n /94/, (TG)n(CG)m /181/ у глобиновых генов; (ТС)П /133/, (тс)п и (TG)m /148/ у рибосомных генов разных организмов. Повторы (CGGGG)n у глобиновых генов /161/ и гена инсулина человека /204/. Встречаются и более сложно организованные последовательности с единицей повтора из 14 п.н. /162,24/.

Основная часть исследователей придерживается мнения, что эти последовательности могут способствовать процессам рекомбинации как в межгенных обменах между сестринскими молекулами ДНК, так и между генами одной и той же молекулы ДНК при ее сворачивании самой на себя. Такого рода межгенные перестройки могут быть использованы для одинакового эволюционирования родственных дуплицированных генов, не затрагивая при этом окружающих участков, а также в коррекции генов, чтобы сохранить гомогенность всего семейства тандемно повторяющихся генов /181,127,50/.

1.7. Способность некоторых "простых" последовательностей к переходу в z-конформацию ДНК

Интересно отметить, что "простые" последовательности ДНК (а)п разной протяженности обнаружены в геноме многих эукариот /95/. В последнее время большое внимание сосредоточено на том, что эти последовательности ДНК способны переходить в z-конформацию /156/. Впервые z-форма ДНК была обнаружена в молекулах, которые содержат протяженные чередующиеся (сс|)п или (cf)n по~* следовательности /214,15/. Эти исследования проводились в системах in vitro в присутствии высоких концентраций разных солей и этанола с последующим спектральным анализом /более подробно см. 95,156/. При помощи антител, специфически связывающихся с

- ЗІ -

Z-формой ДНК, показано существование z-конформации ДНК в разных биологических системах /154/. Из ядра дрозофилы выделены белки, которые способны связываться с z-формой ДНК /155/. Существование таких специфических белков указывает на возможную связь этих последовательностей с какой-то функцией физиологически активной ДНК. Однако пока мы не знаем, какие именно функции они выполняют. Miesfeia с соавторами /147/ и Hamada с соавторами /96/ предполагают, что эти z-элементы ДНК в гаплоидном геноме могут быть расположены с интервалами в 50-100 тыс. п.н. ДНК эукариот организована в домены /159/, т.е. состоит из петель, которые периодически прикреплены к матриксу; прикрепленные петли образуют независимые суперспирализованные единицы. Поскольку они имеют размеры 50-100 тыс. п.н., а z-элементы выявляются с тем же самым интервалом, то можно допустить существование одного z-элемента в каждом домене. Ввиду того, что от конформации доменов зависит их транскрипционная активность либо инертность, вполне возможно, что присутствие такого z-элемента отвечает за инактивацию домена путем образования структуры хроматина с более высокой степенью организации. Мы уже выше рассмотрели многочисленные случаи рекомбинаций, в которых участвовали z-элементы. Интересно отметить, что в участке генома крысы, в котором произошла интеграция ДНК вируса sv-40, также обнаружен повтор №)п /191/. Все эти примеры позволяют предполагать, что конформационно пластичная (а8)п последовательность может участвовать в перестройках ДНК, которые происходят под действием рекомбинационных белков. Обычно ДНК находится в конформационном равновесии между правой спиралью В-формы ДНК и левой спиралью z-формы ДНК. Последовательно (|с)п может быстро переходить в z-конформащда, поэтому значительная часть таких элементов в каждый данный момент может не на-

ходиться ни в правой, ни в левой спирали, В такой форме эти цепи легко могут раскрываться и рекомбинировать с другой открытой цепью гомологичной ДНК.

Еще одна возмогшая функция z-формы ДНК высказана Wamsley и соавторами /213,198/. При клонировании экстрахромосомальной рДНК тетрахимены в дрожжевой векторной системе (Saccharomyces cerevi-siae) обнаружено, что к концам молекул рДНК каким-то образом при-соединяется поли(ас)п* в геноме этого представителя дрожжей найдено приблизительно 30 таких z-элементов, которые также локализованы на концах дрожжевой хромосомы в области теломеров, поэтому авторы предполагают участие z-формы ДНК в функции теломеров.

Таким образом, суммируя все вышесказанное, можно заключить, что z-элементы могут выполнять важную роль в организации хроматина, а также в перестройках генома, которые непрерывно протекают в развивающихся биологических системах.

1.8. "Простые" повторяющиеся.последовательности, входящие в состав генов, кодирующих фибриллярные белки

До сих пор мы рассматривали "простые" последовательноети.ДНК, расположенные в фланкирующих областях или в интронах генов, т.е. "простые" последовательности, которые прямо не участвуют в коди- .. ровании белковых .структур.Если обратить внимание на структуру фибриллярных белков,то видно,что они содержат участки из повторяющихся коротких аминокислотных последовательностей.Так, например, молекула коллагена с молекулярной массой 300 тыс.дальтон состоит на одну треть из глицина и на одну четверть из пролина или оксипро-

лина. Б первичной структуре коллагена (кроме концевых участков) строго повторяется единица - (Gly-X-Y) -, где У - как правило пролин или оксипролин. При исследованиях гена коллагена (38 тыс. п.н.) обнаружено, что ген содержит больше 50 экзонов, при этом основная их часть построена из блоков из 54 п.н. (см. рис. 2). Предполагается, что такое строение могло возникнуть в результате дупликации и амплификации небольшого гена-предшественника /221,58/. Сходную организацию имеют и другие гены, кодирующие фибриллярные белки /224,203/.

инттэон

интрон.

Gly-X-Y-Gly-X-Y-Gly-X-Y-Gly-X-Y-Gly-X-Y-Gly-X-Y

П.Н.

П.Н.

П.Н.

54 п.н.

54 п.н.

Рис. 2. Строение гена коллагена <х.2(1) /58/

П.9. "Простые" последовательности в геноме вируса Эпштейн-Барра

"Простая'последовательность длиной около 700 п.н.обнаружена в геноме вируса Эпштейн-Барра /104,105/.Повтор содержит комбинации триплетов: 5*-GGG-3* (I); S^GCA-O* (2) и 5'-GGA-3' (3),которые формируют три единицы повтора: gcagga (23-Н); gcaggagga (233-

N1) И GGGGCAGGA (I23-U2).ПоВТОрЫ.Н И N1 ОбЫЧНО раСПОЛОЖвНЫ МЄЖДУ

двумя или несколькими блоками IT2. Внутри самого повтора симметрии более высокого уровня не обнаружены.

Повтор транскрибируется в составе.цитоплазматической поли-аденилированной РНК размером.3,7 тыс.п.н. при латентной инфекции в трансформированных клетках, и в составе цитоплазматических по-лиаденилированных РНК размером 2,2; 1,9 и 1,5 тыс.п.н. при продуктивной инфекции клеток.

В инфицированных или.опухолевых клетках вирус Эпштейн-Барра присутствует в неинтегрированной форме,в виде множественных эпи-сомальных элементов,которые ковалентно замкнуты,благодаря.концевым повторам на обоих концах линейной молекулы ДНК вируса.Количество таких элементов колеблется от 5 до 800 копий в разных линиях клеток /215/. Тем не менее небольшая часть вирусных последовательностей может быть интегрирована в геном клетки.

В ДНК двух.линий.клеток опухолей человека, индуцированных вирусом Эпштейн-Барра, Henderson и соавт. /106/ обнаружили интегрированные участки вирусного генома, которые расположены между клеточными последовательностями ДНК, имеющими гомологию с "простым" повтором вируса. Поэтому авторы высказали предположение,что благодаря повтору происходит интеграция вирусной ДНК в геном . клетки. Детальные.исследования по гибридизации указывают на то, что вирусный повтор не принимает прямого участия в процессе ин-

теграции, но поскольку в обеих линиях клеток вирусные последовательности встроились в аналогичные клеточные последовательности, хотя и в разных хромосомах, наличие таких комплементарных участков ДНК как в вирусе, так и в геноме клетки-хозяина может направлять рекомбинацию между обоими геномами.

Пока не получены данные о первичной структуре клонированных участков ДНК этих линий клеток, содержащих места соединения вирусных и клеточных последовательностей. Неизвестна степень гомологии между клеточными последовательностями и "простшл" повтором вируса, а также расстояние, на котором клеточный повтор находится от места соединения.

Таким образом, рассмотренные примеры демонстрируют несколько возможных функций "простых" последовательностей ДНК в процессах поддержания стабильности структуры ДНК, рекомбинации, транспозиции, а также в активации генов. На данном этапе, однако, еще трудно составить определенное представление о деталях механизмов участия этих последовательностей в биологических процессах, поскольку почти все сведения о "простых" последовательностях почерпнуты при изучении структуры и организации участков генома-эука-риот. Однако уже сейчас ясно, что эти последовательности мггут играть важную роль и дальнейшее их изучение сможет пролить свет на многие важные механизмы организации и экспрессии эукариотичес-кого генома.

Полипиримидиновые-полипуриновые последовательности ДНК, их возможные функции

Последовательности ДНК, подобные сателлитным, обнаружены также в эухроматиновой области хромосом, вблизи от активно транскрибирующихся генов, или в их нитронах.

Например, в одном интроне гена овальбумина X цыплят обнаружен "простой" повтор, в котором 36 раз повторяется последовательность из пяти нуклеотидов З -тстсс-з /143/. Этими же авторами показана другая последовательность, состоящая из 27 повторов последовательности 5 -GGAAG-3 2500 п.н. от 5 -начала транскрипции гена овотрансферина цыплят, а также родственная, но несколько иная последовательность в соответствующей области гена овотрансферина фазанов, в которой 5!-GGAAA-3 повторяется 55 раз.

Б геноме мыши тоже обнаружена похожая последовательность вблизи гена иммуноглобулина С о (26 повторов блока 5I-GAAGA-3 ) /57/. Этот повтор обладает большим сходством с элементом, найденным в интроне гена овальбумина X цыплят (только в другом направлении по отношению к транскрипции). Пока неизвестно, относится ли эта последовательность к повторяющимся последовательностям генома мыши. В геноме человека вблизи псевдогена А-ак-тина обнаружена последовательность, в которой 43 раза повторяется блок 5f-GAAA-3 /149/, при этом данная последовательность относится к высокоповторяющимся последовательностям генома человека. В интронах различных областей иммуноглобулиновых генов разных представителей эукариот также обнаружен целый ряд "простых" последовательностей, состоящих из полипиримидиновых-полипуриновых блоков, Например: (5 -GGAGA-3f)24» (5f-GGGAGA-3f)l2» (5» GA-3 ) /164,124/. Все эти последовательности характеризуются тотальной асимметрией расположения оснований: пуринов - по одной, а пиримидинов - по другой цепи. Такие регулярно построенные полипиримидин-полипуриновые блоки имеют большое сходство с сатиляитными ДНК, которые показаны в геноме дрозофилы (поли (AAGAG) и nOOT(AAGAGAG) /82/), только вышеописанные элементы короче. На примере этих "простых" повторяющихся последовательностей у птиц авторами предполагается /143/, что некоторые или даже все эти элементы могут быть организованы в более протяженные повторы в неактивной области генома, и соответствуют множественным сателлитным компонентам, которые выделены из кур и многих других птиц с помощью центрифугирования суммарной ДНК в градиентах плотности CsCi /52/. Как это показано для более сложных высокоповторяющихся последовательностей (например, ХШ-пов-торы в геноме человека): отдельные их элементы рассеяны между уникальными последовательностями генома, что указывает на некоторую их мобильность в геноме /55/.

Судя по гомологии обнаруженных "простых" последовательностей вблизи генов овотрансферина у фазанов и кур, авторами предполагается, что соответствующие гены сформировались из одного локуса предшественника, а в процессе эволюции и дивергенции благодаря мутациям могли возникнуть различия между "простыми" повторами. Не исключено, что эти различия могли возникнуть путем независимой амплификации короткой, богатой пуринами последовательности из генома предшественника, если допустить, что первоначальная последовательность служила "горячей точкой" для амплификации. Исследования соответствующих областей в геномах других птиц могут помочь решению этого вопроса.

Полшшримидиновые блоки длиной от нескольких десятков до нескольких сотен п.н. со случайной или регулярной организацией /основная часть повтора состоит из ()н/ оснований обнаружены в фланкирующих областях или в интронах целого ряда генов цыпленка, кодирующих белки яйца: оватрансферин /143,49/, лизоцим /18/, овальбумин X и У /101,102,103/. Все перечисленные гены экспрес-сируются в яйцеводе под контролем сходных стероидных гормонов /7,35/. Вполне возможно, что вышеописанные повторяющиеся последовательности, благодаря их близкой структуре и месту локализации, принимают участие в регуляции экспрессии соответствующих генов /7,140,181/.

В этом отношении интересные данные получены Dubvig и соавт. /69/ и Johnson и Morgan /120/. Ими показано, что такие полипири-мидиновые-полипуриновые блоки способны образовывать необычные вторичные структуры, характеризующиеся наличием как одноцепочеч-ных участков, так и участков, формирующихся из четырех цепей ДНК.

В ДНК большинства высших организмов содержатся области,обогащенные пуриновими или пиримидиновыми основаниями. Такие области обычно имеют очень небольшие "вкрапления" иных нуклеотидов. В состав полипиримидиновых блоков большей частью входят оба пиримидин овых основания, но иногда такие блоки содержат только одно из оснований, то есть представляют собой гомополимврные последовательности. Методы выделения обогащенных ОДНЕМ типом оснований последовательности ДНК, основанные на хишческой деградации молекул, описаны недавно в обзоре /7/. В последнее время для получения полипиримидиновых блоков стали использовать метод аффинной хроматографии суммарной ДНК на колонках с поли[а(оА)"]-целлюлозой /29,31/. Количество полипиримидиновых (и соответственно полипу-риновых) блоков в геноме разных организмов варьируют от 0,1 до 10$ всей ДНК /7/. Размеры таких блоков варьируют от нескольких десятков до нескольких сотен п.н. Найдены различные типы расположения полипиримидиновых последовательностей в геномах. Так, у мыши 1,3$ всей ДНК составляют полипиримидиновые зоны длиной 20-200 п.н., которые равномерно распределены по всему геному с ин-тервалами (12-15).10 п.н. /29/. Аналогичное распределение блоков наблюдалось и в геноме человека, но расстояние между блока-ми составляет (20-25)»10 п.н, /32/, Иная организация полипиримидиновых блоков найдена у дрозофилы, пчелы, морского ежа /53/ и кур /17/: блоки расположены вдоль одной цепи ДНК на довольно близком расстоянии друг от друга - приблизительно 1,5 тыс.п.н. Общее число блоков у разных организмов варьирует от 100 до 25000 /7/, причем в геномах высших организмов их намного больше, чем у низших /32/.

Небольшие полипиримидиновые блоки находятся в составе других типов последовательностей. Например, третья часть всех инвертированных повторов крысы (11000) содержит полипиримидиновые участки длиной приблизительно 80 п.н. /197/. Распределение,число и длина блоков отличаются в разных по частоте повторения последовательностях. Среди умеренно повторяющихся последовательностей число полипиримидиновых участков больше, а длина их меньше, чем среди уникальных последовательностей. Предпочтительное расположение полипиримидиновых блоков внутри повторяющихся последовательностей отмечается для ряда объектов /29,31,8,148,143/.

"Простые" повторяющиеся последовательности, входящие в состав генов, кодирующих фибриллярные белки

Еще в 1976 году Smith /182/ выдвинул гипотезы о том, что повторяющиеся последовательности могут сохранять гомогенность, если их повергнуть быстрой коррекции или амплификации с помощью неравного кроссинговера. Хотя эта гипотеза и может объяснять как гомогенность сателлитных ДНК, так и их быструю дивергенцию, она не может легко объяснять гомогенность сложных тандемов генов.

Для коррекции генов предложено два механизма: неравный крое-синговер /III/ и конверсия генов /181,20/. В обоих механизмах большое внимание сосредоточено на гомологичных фланкирующих областях генов, которые могут увеличивать возможности рекомбинаций. Дополнительные сигналы, такие, как повторы "простых" последовательностей могут повлиять на коррекцию генов, функционируя как "горячие точки" рекомбинации /127,181,21,50,114/.

На примере трех блоков повтора гистоновых генов, у которых в гомологичных спейсерных областях в аналогичной позиции расположены повторы "простых" последовательностей, Kedes предполагает, что если рекомбинация зависит от скорости образования комплементарных пар оснований, то эта "простая" последовательность будет восстанавливаться гораздо быстрее, чем остальной сегмент гистоновых генов. При этом последующая миграция разветвления далее восстанавливает всю единицу повтора в точном порядке. Таким образом, такая застежка-"молния" ("zipper") может уменьшать вероятность рекомбинации со случайной, но похожей областью ДНК. Решающее значение при этом имеет несколько сниженная скорость ре-ассоциации в результате неправильного спаривания оснований, и молекулы с неполной гомологией так и не успевают сформироваться из-за быстрой реассоциации гомологичных последовательностей Л27/. Благодаря этим "zipper" или "z-элементам" может повышаться возможность рекомбинации между гомологичными генами, действуя как механизм коррекции генов и уменьшая случайные рекомбинации.

Данный механизм хорошо иллюстрируется на следующем примере. При исследованиях сегмента ДНК мыши длиной 4 тыс. п.н., в котором расположено 5 генов вариабельной области тяжелой цепи имму-глобулинов, установлено, что кодирующие области имеют больше 75$-гомологии, а фланкирующие - несколько ниже. На расстоянии приблизительно 380 п.н. от начала транскрипции этих генов обнаружены "простые" повторяющиеся последовательности, построенные из повторов б -ТСС-З и б -ТСА-з /50/. У двух из этих пяти генов в более дистальной части фланкирующих областей ДНК в 5 -направлении от "простого" повтора выявляется меньшая гомология; при этом у них "простая" последовательность отличается от остальных трех генов мозаичным строением обоих блоков повтора (у трех генов "простые" последовательности организованы в форме s -dcOn (тсА)т-з ). На основании вышеописанных данных авторы предполагают, что эти гены произошли путем дупликации общего предшественника и, судя по степени дивергенции (18$), разделились сравнительно давно. Обсуждая проблему гомогенности этого длинного участка из 5 генов (с высокой степенью гомологии), авторы предполагают участие каких-то дополнительных факторов, кроме тех, которые влияют на экспрессию генов, поскольку сохранение гомологии в фланкирующих областях генов может привести к селективным взаимодействиям родственных генов, важных для сохранения этих семейств генов в эволюции. Эти взаимодействия могут начинаться в повторах "простых" последовательностей с последующей гомологичной рекомбинацией между двумя генами и привести к перестройке соответствующих генов. Гены одного подкласса, благодаря аналогичному "простому" повтору могут легко рекомбинировать между собой. Взаимодействия между разными подклассами происходит намного реже, но тем не менее это не исключено (например, вышеописанные "одинокие" гистоновые гены). Существование в фланкирующих областях разных "простых" последовательностей, возможно,указывает на их различную рекомбинационную способность /50/.

Несколько более сложно организованные "простые" повторяющиеся последовательности найдены в областях иммуноглобулиновых генов, где происходит переключение разных классов константной области тяжелых цепей ИГ генов. Эти области названы s-элементами /124/. Ранее было показано, что в геноме мыши в s области расположен тандемный повтор из 49 п.н. /125/, а в s области - повтор из 80 п.н. /57,157/. В разных областях sи , s ,, s обна-руженц последовательности длиной в 20-30 п.н., построенные из двух единиц повтора: S -GAGCT И S -GGGGT /153,92/. Авторы предполагают, что благодаря этим элементам и происходит рекомбинация, которая приводит к функциональному переключению определенной области. Но поскольку последовательности повтора в случаях разных пар константных сегментов могут различаться, то можно предполагать участие специальных ферментов /153/.

Сходные "простые" повторяющиеся последовательности обнаружены и в ДНК других семейств тандемно повторяющихся генов, где они также расположены в фланкирующихся областях или в интронах: повторы (TG)n и (ст)п у гистоновых генов /194/, (TG)n /94/, (TG)n(CG)m /181/ у глобиновых генов; (ТС)П /133/, (тс)п и (TG)m /148/ у рибосомных генов разных организмов. Повторы (CGGGG)n у глобиновых генов /161/ и гена инсулина человека /204/. Встречаются и более сложно организованные последовательности с единицей повтора из 14 п.н. /162,24/.

Основная часть исследователей придерживается мнения, что эти последовательности могут способствовать процессам рекомбинации как в межгенных обменах между сестринскими молекулами ДНК, так и между генами одной и той же молекулы ДНК при ее сворачивании самой на себя. Такого рода межгенные перестройки могут быть использованы для одинакового эволюционирования родственных дуплицированных генов, не затрагивая при этом окружающих участков, а также в коррекции генов, чтобы сохранить гомогенность всего семейства тандемно повторяющихся генов /181,127,50/.

Приготовление компетентных клеток Е.СОІІ и их трансформация плазмидной ДНК

Нет ясности в вопросе о том, в какой форме вирусная ДНК встраивается в клеточную. Поскольку район контакта вирусной и клеточной ДНК ограничен двумя вирусными и двумя соседними парами клеточных нуклеотидов, можно допустить существование циркулярной промежуточной формы вирусной ДНК, возможно, без ковалентной связи между концами молекулы /83,185,186/. Такой механизм легко объясняет те случаи, когда правый и.левый концы молекулы вирусной ДНК встроены вместе /212,218,91,185,65/. Не исключено, что в образовании таких циркулярных структур принимает участие терминальный вирусный белок, который ковалентно связан с концами молекулы ДНК аденовирусов в вирионе /167/.

С развитием методов молекулярного клонирования /34,37/ и определения первичной структуры ДНК /145,174/ стало возможным полу-, чать из разных линий клеток в достаточных количествах участки ДНК, содержащие места соединения вирусных и клеточных последовательностей. Этот подход разрешает проводить анализ характера интеграции на более высоком уровне, т.е. на уровне первичной структуры определенных участков ДНК.

В настоящее время получены данные о первичной структуре участков ДНК,, содержащих места соединения вирусных и клеточных по- . следовательностей в целом ряде линий клеток хомяка, крысы.и мыши, трансформированных аденовирусами человека типов 2, 5 и 12, а также из линий клеток опухолей, индуцированных. Ад12.

Общими для всех проанализированных.линий клеток являются де-леции концевых вирусных-последовательностей, длиной от 2 до 174 п.н. /186,83,193,61,173,84,212,218/. Чаще всего наблюдали деле-ции от 6 до 10 п.н. с левого конца молекулы ДНК аденовируса.Поэтому Gablman.H Doerfler /83/ выдвинули предположение, что "горячая" точка рекомбинации существует поблизости 8-Ю нуклеотида от конца молекулы ДНК вируса. Более того, этот участок оказывается расположенным перед высококонсервативной у всех типов аденовирусов последовательностью из 10 п.н. -б -АТААТАТАСС-З , служащей сигналом для инициации репликации вирусной ДНК /188,16, 129,201/.

При сравнении первичной структуры вирусных и клеточных последовательностей в местах соединения между ними не обнаружены протяженные участки с высокой гомологией. Однако компьютерным анализом удалось выявить более или менее выраженные короткие рассеянные гомологичные участки длиной от 3 до 12 п.н. Такие сегменты обнаружены между делетированными концевыми последовательностями вирусной ДНК и замещающими их участками клеточной ДНК, а также между вирусными и примыкающими к ним клеточными последовательностями.

Так, например, из линии клеток хомяка смет, трансформированной Ад12, проклонирован участок ДНК, содержащий место соединения левого конца молекулы ДНК Ад12 с клеточными последовательностями /186/. В данном случае обнаружена деления концевых 174 . п.н. вирусной ДНК. Один три-, два тетра-, один пента- и один ге-птануклеотид идентичны между делетированными вирусными и. примы-. кающими к.месту соединения клеточными нуклеотидами (на рис. 4 подчеркнуты).

Компьютерным анализом показано, что между более протяженными вирусными и клеточными последовательностями, примыкающими к местам соединения, существует большое количество.таких рассеянных гомологичных сегментов длиной от 8 до 12 п.н. (участки меньшего размера не учитывались в данном анализе). При этом они расположены несимметрично относительно точки интеграции в клеточных и вирусных последовательностях.

Компьютерным анализом.показано, что идентичные олигонуклео-тиды длиной от 8 до 12 п.н., соответствующие различным концевым участкам аденовирусной ДНК, встречаются в целом ряде случайно избранных последовательностей ДНК из прокариотических и эукарио-тических организмов /61,84/.

Вое вышеизложенные данные говорят в пользу того,что интеграция аденовирусной ДНК может происходить в множественные участки клеточной ДНК, благодаря коротким гомологичным участкам,которые направляют рекомбинацию между обеими молекулами. Не исключено,что специфические сигналы, контролирующие взаимодействия между вирусными и клеточными ДНК, расположены далеко от соединения обоих геномов, и.скрыты в необнаруженных до сих особых вторичных структурах /61/. Также не понятно, что представляют собой последовательности нормальной клетки, комплементарные вирусспецифическим /123, 78,11,9/; принимают.ли они участие, и если принимают, то каким образом в процессе интеграции.

Поэтому необходимо определить первичную структуру более протяженных участков клеточных последовательностей,примыкающих к местам соединения вирусных и. клеточных геномов для большого количества участков ДНК из трансформированных и опухолевых линий клеток. Может быть,таким образом удастся выявить какие-то общие структуры или закономерности для объяснения механизмов интеграции аденовирусной ДНК в геном клетки-хозяина,как это,например,показано для молекулы I6s рибосомной РНК: полностью отличающиеся по первичной .. структуре последовательности могут образовать идентичную или сходную вторичную структуру /20бДНе исключено, что интеграция вирусной ДНК в геном клетки действительно имеет случайный характер,либо следующие за интеграцией перестройки, делеции или амплификации маскируют любую специфичность, которая сопровождает процесс интеграции /65/.

Выяснение локализации участков генома аденовируса типа 5, комплементарных ДНК рекомбинантных клонов

К раствору плазмидной ДНК в буфере ТЕ добавляли кристаллический хлористый цезий из расчета I г на I мл, и раствор бромистого этидия до конечной концентрации 600 мкг/мл.. Полученный раствор переносили в центрифужные пробирки и центрифугировали при 42000 об/мин в течение 36-48 часов при І8С в роторе Ті-50 (уль-трацентрифута Beckman L2-65, США). После этого отбирали-плазмид-ную зону и для удаления бромистого этидия экстрагировали равным, объемом изопропанола. Затем плазмидную фракцию разводили в 3 раза водой и осаждали ДНК равным объемом изопропанола. Осадок промывали 70$ этанолом, ДНК переосаждали из 0,3 М ацетата натрия рН 5,5 этанолом, дважды промывали 70$ этанолом, высушивали и растворяли в ТЕ буфере. ДНК хранили при -20С.

Для экспресс-анализа плазмидной ДНК плазмиды выделяли методом, разработанным Holmes и Quigley Доэ/. Для этого клетки Е. coli, содержащие интересующий плазмидныи клон, выращивали в 5 мл среды с антибиотиком при 37С до стационарной фазы в течение 8-12 часов. Клетки осаждали центрифугированием при 4000 об/мин (центрифуга Janetzki К23, ГДР) в течение 10 мин при 4С и суспендировали в 350 мкл буфера, содержащего 50 мМ трис-нсі рН 8,0, 8$ сахарозы, Ъ% тритона Х-100 (Serva, ФРГ) и 50 мМ ЭДТА. Суспензию переносили в полипропиленовые центрифужные пробирки емкостью на 1,5 мл и добавляли 25 мкл свежеприготовленного раствора, со-, держащего 10 мМ трис-нсі рН 8,3 и 10 мг/мл лизоцима (sigma,CHIA). Пробирки на 40 секунд помещали в кипящую водяную баню, а затем быстро охлаждали в течение 5 мин в ледяной бане. Клеточную ДНК осаждали центрифугированием при 12000 об/мин в настольной центрифуге Eppendorf 5412 (ФРГ) в течение 10 мин при 4 С. К надоса-дочной жидкости добавляли равный объем изопропанола и ДНК осаждали центрифугированием в прежних условиях. Осадок промывали 70$.этанолом, переосаждали этанолом из 0,3 М ацетата натрия рН 5,5, дважды промывали 70$ этанолом, высушивали, и ДНК растворяли в ТЕ буфере. Выход ДНК составлял 1-5 мкг. Полученную таким, способом плазмидную ДНК использовали для рестриктного анализа.

Гидролиз ДНК рестриктазами обычно проводили в универсальном буфере, содержащем 20 мМ трис-нсі рН 7,6, 50 мМ ЖаС1, 10 мМ MgCi2, І.мМ ДТТ при 37С в течение 1-2 часов, добавляя на. I мкг . ДНК I ед. акт. фермента. При расщеплении ДНК рестриктазами ватні, EcoRi, Tagi, хьаі и Xhoi концентрация itfaci в том же буфере составляла 150 мМ. Для рестриктазы Smai использовали буфер следующего состава: 20 мМ ксі, 6 мМ трис-нсі рН 8,0, 6 мМ MgCl2 и 6 мМ & -меркаптоэтанол. Гидролиз ДНК рестриктазой Tagi проводили при 65С.

Концентрация ДНК в реакционной смеси составляла 50-200 мкг/мл. Полноту расщепления проверяли электрофорезом аликвоты гидролиза-та ДНК в полиакриламидном геле (ПААГ) или в агарозном геле.

Реакцию останавливали добавлением к смеси ЭДТА до концентрации 5 мМ и нагреванием пробы в течение 10 мин при 65С, Реакционную смесь депротеинизировали равным объемом фенол: хлороформ (1:1) или хлороформом. ДНК из водной фазы осаждали этанолом,осадок дважды промывали 70$ этанолом, высушивали и растворяли в воде. Полученные гидролизом фрагменты ДНК разделяли в геле агаро-зы или в ПААГе (см. раздел 9).

Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК проводили.в пластинах полиакриламидного или агарозного геля.. Для ПААГ ис- .. пользовали буфер ТВЕ рН 8,3 (50 мМ трис-основание, 50 мМ Н3ВО3, 5 мМ. ЭДТА)., для агарозных гелей - буфер ТАЕ (40 мМ трис-ацетат рН 7,4, 5 мМ ацетат натрия, I мМ ЭДТА) Концентрацию гелей и его размеры выбирали в.зависимости . от молекулярного веса разделяемых .фрагментов ДНК. Для разделения фрагментов ДНК размерами от 0,5 до 20 тыс. п.н. использовали 0,8-1,2$ гели агарозы. Для этого агарозу (Sigma, США), плавили в ТАЕ-буфере на кипящей водяной бане или в автоклаве и после охлаждения раствора до 50С готовили гели как описано /6 /.Для разделения фрагментов ДНК размером от 30 до 2000 п.н. использовали обычно Ъ% ПААГ длиной 20-40 см, толщиной 0,6-1,5 мм. Соотношение акриламид/метиленбисакриламид во всех случаях составляло 30:1. Гель готовили на ТВЕ буфере, к раствору в качестве инициаторов для полимеризации добавляли 1/1000 объема тетраметил-этилендиамина (TEMED, Reanai, ВНР) и 1/100 объема 10$ раствора персульфата аммония (Reanai, ВНР), Гель полимеризовали между двумя стеклянными пластинами.

ДНК наносили в растворе % глицерина и 2 мМ ЭДТА с маркерными красителями (0,01$ бромфенолового синего и 0,01$ ксиленциа-нола). Электрофорез проводили при комнатной температуре при напряжении 0,5-10 вольт/см геля, следя за положением краски.

Фрагменты ДНК после окончания электрофореза выявляли окрашиванием геля в растворе бромистого этидия (I мкг/мл) и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете (266 нм) на пленку Микрат-300 через.оранжевый светофильтр 0С-І2, используя фотоаппарат "Зенит-ЗМ". Меченые фрагменты ДНК выявляли радиоавтографией на рентгеновской пленке (см. раздел 4).

Похожие диссертации на "Простые" последовательности в геноме крысы, комплементарные ДНК аденовируса человека типа 5