Введение к работе
Акт2альность_пр_облеш Эффективное определение нуклеотидных последовательностей и кодируемых ими белков, использование методов спектроскопии и рентгеноструктурного анализа приводят к возрастанию информации о первичных - третичных структурах белковых молекул и их биологических свойств. В настоящее время известно более 25000 аминокислотных последовательностей и около 500 пространственных структур ферментов, иммуноглобулинов, структурных и иных белков. Привлечение этой информации наряду' с разработкой и использованием теоретических методов стимулировали исследования в молекулярной* биологии, вирусологии, биохимии, биофизике.
Практические задачи белковой инженерии находятся на стыке этих дисциплин. Одной из ключевых в этих областях является проблема белка. Несмотря на большое количество работ по моделированию пространственной структуры белка, эта проблема не решена. Однако, имеющуюся информацию о структурных и функциональных особенностях белкоЕых молекул можно эффективно использовать, если исходить из следующей концепции: перестройки, которые мы направлено индуцируем не должны противоречить природным структурным изменениям в белках в ходе эволюции. В этом случае соответствующий организм (клетка, бактерия, вирус) остается жизнеспособным и наоборот. Для этого необходимо описать инвариантные характеристики молекул белков, создать их параметрические образы на основе изучения первичных - третичных структур. Использование этих характеристик позволит контролировать структурную и функциональную консервативность (неконсервативность) молекулы при внесении в нее изменений. Такой подход является такке этапом в решении фундаментальной проблемы белка - установлении его прострзнстЕенной структуры по аминокислотной последовательности. 0 другой стороны, перспективная программа "Геном человека" требует создания универсальных банков первичных - третичных структур белков для функциональной идентификации вновь определяемых аминокислотных последовательностей. Одним из способов сокращения времени обработки этих данных является создание банка
образов белков и нуклеотидяых последовательностей - групп параметров, по которым мокно определять и классифицировать родственные последовательности или их фрагменты. Отметим, что идея сопоставления характеристических признаков при изучении и классификации генетических видов была заложена Н.И. Вавиловым в теорию о гомологических рядах в наследственной изменчивости. В настоящее время ее.необходимо воплотить на молекулярном-уровне.
Целью настоящей работы является определение объективных параметров, характеризующих структурные и, отчасти, функциональные' особенности белковых молекул. Эти параметры предполагаются инвариантными для белков с различными биологическими' свойствами в самых разных организмах. Главное внимание уделяется следующим задачам:
'I. Статистический анализ пространственно сближенных аминокислотных остатков (АО) 20 канонических типов в третичных структурах, изучение вариабельности АО в зависимости от их пространственного окружения в ходе эволюции белков.
2. Исследование распределений соседних аминокислот в
первичных структурах, их связей с пространственным расположением
остатков. Изучение влияния распределений соседних аминокислот в
коротких пептидных сегментвх на допустимость мутационных замен в
белках.
3. Разработка теоретических методов редактирования пептид
ных сегментов без изменения - их структурных и функциональных
свойств в конкретных белках.
'4/ Поисковые алгоритмы для интерпретации неизвестных структур, прогноза активных центров, областей связывания с лигандом, антигенных детерминант в эукариотических и вирусных белках - цель наших исследований в прикладной области.
Нахчная_новизна_5абрты. На основании, изучения пространственно сближенных аминокислотных остатков показано, что существуют статистически значимые тенденции во взаимном расположении АО, по сравнению с их случайным расположением в третичных структурах. Имеется связь мезду функционально допустимыми -мутационными заменами и пространственным окружением остатков. Распределения остатков в коротких пептидных сегментах ($10 АО) также влияют на возможные аминокислотные замены. - Существуют .статистически
значимые, взаимосвязанные тенденции в расположении.АО в. первичных и третичных структурах. Иг можно описать в- терминах'линейной и пространственной "сопряженности" остатков. ОдношагоЕые мутации в соответствующих кодонах соседних аминокислот в среднем не выводят их из множества сопряженных пар в первичных и одновременно в пространственных структурах белков. Этим обеспечивается своего рода "конформацшнная защита" белка, которая, в конечном счете, детерминирована структурой генетического кода. Построена мера сходства АО, зависящая только от их расположения в кластерах (совокупностях) пространственно сближенных остатков, что позволяет оценить плотность упаковки остатков - их координационные числа вдоль полнпептидной цепи. Высказано аргументированное предположение, что возможный код взаимного пространственного узнавания аминокислот не является синглетным ("остаток - остаток"), но групповым ("остаток - группа АО" или "группа - группа"). Эти результаты дает возможность
-
редактировать пептидные сегменты в белках без изменения их структурных и функциональных свойств;
-
осуществлять поиск структурных аналогов первичных структур и включать их в семейства гомологов;
-
изучать взаимодействие внутрибелковыг доменов" и'-субъединиц белковых молекул;
-
в перспективе осуществить создание банка образов белков. Это не только консенсусные пептидные сегменты,но и мотивы высших структурных уровней, включая третичную структуру белка.
Шї^ОгШЗкТ^еск^-Ц^ІШРсть.работн.
-
Разработан метод прогноза возможных мутационных замен аминокислотных остатков в белках. В качестве математического алгоритма этот метод реализован в виде программы и был адаптирован на панкреатических рибонуклеазах. Таким образом можно прогнозировать потенциальную вариабельность аминокислотных последовательностей, тестировать активные центры ферментов, возможные антигенные детерминанты.
-
Реализован метод сопоставления отдаленно гомологичных пептидных сегментов по профилям их плотности упаковки - приближения координационных чисел. Метод позволяет проводить сравнение неизвестной структуры с банком первичных структур для ее .интер-
лретации("Profile"). Он опробован при изучении белков ИЗ Chiro-nomus thummi и для множественного выравнивания слабо гомологичных белков ( на примере цитохромов Р-450).
-
Математической модификацией этого алгоритма является метод "Motiv" для выявления консенсусних областей в первичной структуре одного или множества белков,-Это еще один- способ.:-идентификации белков. Пример - определение ламининсвязывавдего белка человека.
-
На основе полученных данных по пространственной сопряженности (сближенности) аминокислотных остатков создана методика .прогнозирования областей антигенных детерминант, комплементарных иммуноглобулинподобным . доменам (на примере гликощютеина Ebola-вируса).
Апробаідя_раОота. Результаты работы докладывались на 1-м и 3-м Всесоюзных совещаниях "Теоретические исследования и банки данных по молекулярной биологии и генетике" (Новосибирск, 1986; 1988), на 5-м Бюхеровском симпозиуме "Оксиредуктазы и перспективы их применения" (Берлин, 1988), на 5-й Всесоюзной конференции "Цитохромы Р-450 и модификация макромолекул" (Ялта, 1989), на мекдународной конференции "Моделирование и вычислительные методы в молекулярной биологии к генетике" (Новосибирск, 1990), на Всесоюзной школе "Молекулярно-клеточше механизмы иммунной регуляции гомеостаза и проблемы математического моделирования" (Красноярск, 1990).
-О^ьеУ-И-Структпда^аботы. диссертация состоит из Введения, пяти глав, Заключения, Выводов и Приложения. Общий объем работы 192 страницы. Из них 132 стр. машинописного текста (исключая список литературы и оглавление), 30 рисунков, 12 таблиц. Количество цитируемых работ 163.