Введение к работе
Актуальность проблемы. В последнее десятилетие были достигнуты значительные успехи в трансформации и трансфекции клеток высших эукариот. Однако для решения многих задач мало ввести в клетку нужную последовательность ДНК: часто ее надо интегрировать в строго определенный локус генома (проблема генного таргетинга). Кроме того, для решения ряда задач может понадобиться осуществление высокоточных и регулируемых рекомбинационных обменов между введенной и геномной ДНК и между различными участками генома. Но использование эндогенной общей рекомбинации высших эукариот для решения таких проблем значительно осложнено тем, что в соматических клетках высших эукариот уровень хромосомальной негомологичной рекомбинации существенно выше уровня гомологичной рекомбинации. Кроме того, системы общей рекомбинации эукариот сложны и мало изучены.
Все это и стимулировало применение альтернативного подхода -использование сайт-специфической рекомбинащш для осуществления регулируемых генетических перестроек в клетках высших эукариот. Это стало возможно благодаря высокой эффективности и относительной простоте таких реакций. Недавно ряд групп успешно использовал сайт-специфическую рекомбинацию для регуляции экспрессии генов и
ГенНОГО ТаргеТИНГа В ВЫСШИХ ЭукариОТЭХ (Golic and Linquist, 1989; Sauer and Henderson, 1989; Dale and Ow, 1990; Onouchi et al. , 1991; Sauer and Henderson, 1991; Fukushige and Sauer, 1992).
Регуляцию экспрессии генов обычно осуществляли посредством рекомбинационных делеций фрагментов ДНК. Генный таргетинг представлял собой интеграцию плазмиды, несущей еводимый ген, в предетерминированный локус, содержащий соответствующий рекомби-национный сайт. Сегмент ДНК, фланкированный двумя рекомбинацион-ными сайтами в прямой ориентации, является субстратом или продуктом таких реакций. Альтернативной стратегией хромосомального таргетинга и регуляции экспрессии генов может стать использование инвертируемых сегментов ДНК в качестве субстрата для рекомбинаци-онного процесса. Регуляция экспрессии гена посредством смены ориентации его промотора или кодирующей области, расположенных на инвертируемых сегментах ДНК, встречается у прокариот и известна
Как регуЛЯЦИЯ ПО ТИПУ "СМеНЫ фаз" {Rahman et al., 1985; Iida,
1984).
Недавне была осуществлена индукция генов посредством инверси их кодирующих областей с помощью Сге рекомбиназы фага pi (Dale
and Ow, 1990) И реКОМбИНаЗЫ ШЮЗМИДЫ pSRl Z. rouxii (Onouchi et
ai., 1991) в культуре клеток табака. Однако возможности регуляци экспрессии генов по типу "смены фаз" в эукариотических клетках остаются практически неизученными, хотя регуляция экспрессии генов посредством рекомбинационннх делеций исследуется в последние годы очень интенсивно. Кроме того, использование инвертируемых сегментов ДНК может значительно повысить эффективность генного таргетинга. Для этого с помощью сайт-специфической рекомбинации можно было бы замещать инвертируемые сегменты, расположенные на хромосомах, на сегменты, расположенные на плазмидах, т.е. осуществлять генетические обмены по типу "смены сегментов". Основная проблема генного таргетинга посредством сайт-специфической рекомбинационной интеграции состоит в нестабильности интегранта, т.к. он легко делетирует за счет внутримолекулярного рекомбинаци-онного процесса между фланкирующими его рекомбинационными сайтами (Huang et al., 1991). Использование ДЛЯ ГЄННОГО ТаргеТИНГЭ
смены сегментов ДНК позволит добиться стабильной интеграции генов, т.к. интегрировав в хромосому, инвертируемый сегмент не может из нее делетировать, будучи фланкированным рекомбинационшмі сайтами в противоположной, а не в прямой относительной ориентации.
Цель работы. Изучение возможностей применения системы сайт-специфической рекомбинации 2 мкм плазмиды s. cerevisiae для регуляции экспрессии генов по типу "смены фаз" и генетических обменов по типу "смены сегментов" в эукариотических клетках и анализ фак-ров, влияющих на эффективность процессов такой регуляции, с использованием в качестве модели эписомальных дрожжевых плазмид.
Научная новизна и практическая значимость. Впервые была осуществлена регуляция гена по типу "смены фаз" с помощью рекомбинационной системы 2 мкм плазмиды s.cerevisiae. Использование в качестве модели эписомальных дрожжевых плазмид позволило оценить влияние ряда факторов на эффективность такой регуляции. В частности, установлено, что наличие последовательности рекомбинацион-ного сайта frt между промотором и структурной частью регулируемого гена не влияет на эффективность экспрессии последнего в дрож-
жевых клетках.
Впервые осуществлены регулируемые генетические обмены по типу "смени сегментов" с помощью сайт- специфической рекомбинации в эукариогических клетках. Показана высокая эффективность использования положительной селекции сегментов при данном способе регуляции генетических обменов в дрожжах. Предложено использовать генетические обмены по типу "смены сегментов" для осуществления генного таргетинга в клетках эукариот.
Полученные результаты носят приоритетный характер и имеют важное значение для дальнейшего изучения регуляции экспрессии генов и генетических перестроек при сайт-специфической рекомбинации в эукариотических клетках и контролируемой модуляции активности эукариогических генов.
Аппробация работы. Материалы работы представлялись на семинарах лаборатории молекулярных основ онтогенеза НИИ физико-химической биологии им. Белозерского, кафедры химии природных соединений химического факультета МГУ им. Ломоносова и отделения био-хии Висконсинского университета (г. Мадисон, США).
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 403 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы и список цитируемой литературы. Работа проиллюстрирована 7 рисунками и 2 таблицами. Список цитируемой литературы содержит 122 наименования.