Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы (Роль структурно-специфических взаимодействий в формировании транскрипционных комплексов) 5
1.Общие представления о механизмах инициации транскрипции б
1.1 .Характеристика РНК-полимеразы 7
1.2.Структурная организация промоторов 11
1.3. Общие представления о механизмах взаимодействия РНК-полимеразы с промотором 15
2.Особенности ДНК-белковых взаимодействий в транскрипционных комплексах 18
2.1.Топологическая характеристика полимераза-промоторных комплексов 19
2.2.Пространственная организация транскрипционного комплекса 22
2,3. Особенности взаимодействия а-субъединиц РНК-полимеразы с промоторами 24
3. Конформационные свойства ДНК 29
3.1. Конформационные свойства ДНК 29
3.2. Роль легкодеформируемых динуклеотидов в активации транскрипции 32
3.3. Деформация ДНК в комплексах с белками 34
Заключение
Материалы и методы 40
Результаты и их обсуждение 47
1. Локализация участка температуро-зависимых конформационных перестроек в промоторе 47
2. Структурно-функциональная роль динуклеотидов ТА, находящихся между местами взаимодействия а-субъединиц. 53
2.1. Функциональная характеристика 54
2.2. Структурная характеристика комплексов, формируемых РНК-полимеразой с Т7ЛД 60
2.3. Зависимость матричных свойств промотора T7D от положения кинкообразующего динуклеотида ТА 63
3. Структурно-функциональная роль динуклеотидов ТА, находящихся в участках непосредственного контакта с а-субъединицами РНК-полимеразы. 67
3.1. Структурно-функциональная характеристика TlD.32k 68
3.2. Структурно-функциональная характеристика Т7 73
Общее заключение 76
Выводы 81
Список литературы 82
Список сокращении 97
- Общие представления о механизмах взаимодействия РНК-полимеразы с промотором
- Особенности взаимодействия а-субъединиц РНК-полимеразы с промоторами
- Зависимость матричных свойств промотора T7D от положения кинкообразующего динуклеотида ТА
- Структурно-функциональная характеристика TlD.32k
Общие представления о механизмах взаимодействия РНК-полимеразы с промотором
Кроме специфического взаимодействия с промоторами РНК-полимераза может образовать неспецифичекие комплексы практически на любом участке ДНК. О существовании неспецифических комплексов свидетельствует то, что число молекул фермента, взаимодействующих с матрицей в условиях избытка РНК-полимеразы, может значительно превышать число имеющихся на ней промоторных участков. Это, по-видимому, означает, что в клетке РНК-полимераза всегда находится в связанном с ДНК состоянии и, следовательно, поиск промотора осуществляется не только посредством трехмерной диффузии в растворе. Принято считать, что альтернативным механизмом поиска промотора является одномерная диффузия вдоль ДНК. А это значит, что и в ДНК, и в ферменте должны быть определенные модули, обеспечивающие это движение. Их природа пока неизвестна. При образовании неспецифических комплексов не происходит плавления двойной спирали ДНК, необходимого для копирования матричной нити, поэтому образование неспецифических комплексов не зависит от температуры (Williams and Chamberlin,1977, Kadesh et al.,1980).
На начальном этапе взаимодействия РНК-полимеразы с промотором происходит образование так называемого закрытого промоторного комплекса. На этом этапе РНК-полимераза узнает консервативные гексануклеотиды и UP-элемент, если он присутствует в промоторе, но ДНК сохраняет двуспиральную структуру. Закрытый комплекс не способен к синтезу ДНК, он нестабилен и легко диссоциирует при повышении ионной силы или в присутсвии полианионного ингибитора гепарина (Leimo, Record, 1990).
Необходимым этапом энзиматического синтеза РНК является образование открытого промоторного комплекса. Этот процесс включает в себя серию последовательных информационных превращений, приводящих к локальному плавлению ДНК вблизи точки старта (Tsodikov et al.,1998). Стабильность открытых промоторных комплексов и эффективность транскрипции зависят от ряда физико-химических факторов, в том числе от ионной силы среды, т.к. с ее изменением меняется сила электростатического взаимодействия между ДНК и ферментом. На примере промотора ХРд показано, что повышение концентрации катионов калия (К1) влияет на константу ассоциации фермента с промотором, но не влияет на константу изомеризации закрытого промоторного комплекса в открытый (Roe, Record, 1985). Как правило, стабильность открытых промоторных комплексов падает с увеличением ионной силы, т.к. это приводит к увеличению стабильности двойной спирали ДНК, при этом РНК-полимеразе труднее удерживать комплекс в "раскрытом" состоянии и равновесие сдвигается в сторону образования закрытого комплекса.
Основные этапы полимераза-промоторного взаимодейстия отражены в двух-стадийной модели комплексообразования:(СпатЬег1іп,1974) Константы скорости к% и к.2 характеризуют скорость-лимитирующую стадию в процессе комплексообразования, которой могут стать разные этапы полимераза промоторного взаимодействия в зависимости от условий среды (температуры, ионной силы). Температура, при которой образование открытого промоторного комплекса перестает быть скорость-лимитирующей стадией, называется температурой транзиции для данного промотора. Этот параметр отражает физико-химичекие свойства данного участка ДНК и зависит от его нуклеотидной последовательности. Последовательное повышение температуры позволяет имитировать структурно-конформационные превращения транскрипционного комплекса, сопровождающие равновесный процесс комплексообразования, и определить термодинамические и кинетические параметры взаимодействия на разных этапах (Leirmo and Records, 1990). Такие исследования, выполненные на нескольких промоторах, показали, что приведенная выше схема, отражает только ключевые этапы взаимодействия фермента с промотором. Для конкретных промоторов предложены более сложные кинетические модели. Так, например, кинетический анализ взаимодействия РНК-полимеразы с промоторами Т7А1 (Rosenberg et al.,1982), KPR (Leirmo, Record, 1990) и lacUVS (Buc, McClure, 1985) выявил существование промежуточных комплексов, отражающих наличие дополнительных стадий при переходе закрытого комплекса в открытый. Наличие двух типов открьпых комплексов (Oi и Ои) описано для промотора lacUVS (Straney, Crothers 1985, 1987). Функциональная активность этих комплексов также оказалась различной, так Ои с большей вероятностью переходит к продуктивному синтезу полноразмерного РНК-продукта (Straney and Crothers,1985). Наличие двух типов открытых комплексов, различающихся по конформационному состоянию РНК-полимеразы (Ozoline et al. 1993) и по топологическим характеристикам (Масулис и др., 1998), зарегистрировано для промотора D бактериофага Т7.
После образования открытого комплекса возможна инициация синтеза РНК, при этом одна из двух расплетенных цепей служит матрицей для комплементарного спаривания оснований ДНК с гетероциклами субстратов (рибонуклеозидтрифосфатов). После связывания субстратов открытый полимераза-промоторный комплекс становится инициирующим. До перехода к продуктивному синтезу РНК инициирующие комплексы способны осуществлять реакцию абортивного синтеза. При этом образуются короткие олигонуклеотиды длиной от 2 до 8-11 нуклеотидов, а холофермент остается связанным с промотором. В процессе продуктивной инициации при синтезе 8-11 нуклеотидной РНК, происходит отсоединение а-фактора, нарушается контакт с "upstream" областью, и происходит переход инициирующего комплекса в элонгируюший (Krummel and Chamberlin, 1989). а-фактор, освобождающийся из продуктивного комплекса, включается в новый цикл инициации транскрипции. Динамика перехода инициирующего комплекса в элонгирующий зависит от прочности полимераза-промоторного взаимодействия, обусловленного а- и а-субъединицами фермента, а также нуклеотидной последовательностью ДНК в транскрибируемой области (Ellinger et al.,1994).
Первоначально считалось, что реакции абортивного синтеза олиго нуклеотидов и продуктивной элонгации являются последовательными этапами транскрипционного цикла. В настоящее время это представление полностью пересмотрено (Kubori and Shimamoto, 1996; Sen et al.,1998, Sen and Shimomoto, 2000) и доказано, что формирование абортивного и продуктивного комплексов является альтернативными путями инициации транскрипции. Таким образом, процесс инициации транскрипции является сложным и многостадийным. Он не сводится к пассивному узнаванию промоторной ДНК ферментом, а предполагает целый ряд последовательных конформационных превращений как РНК-полимеразы, так и промотора.
Особенности взаимодействия а-субъединиц РНК-полимеразы с промоторами
Как уже указывалось выше, основную роль в образовании транкрипциоиного комплекса играют а-субъединицы РНК-полимеразы, которые распознают функциональные группы азотистых оснований в элементах-10 и -35. Помимо а-субъединиц в непосредственный контакт с промотором могут вступать С-концевые домены одной или обеих а-субъединиц РНК-полимеразы, защищая от гидролизующих агентов связи в пределах одного или двух витков спирали ДНК, соответственно. Почти все исследованные промоторы взаимодейтвуют с а-субъединицами фермента (Ozoline, Tsyganov, 1995), но воздействие а-субъдиниц на активность промоторов неодинаково (Ross et al.,1998).
Известно, что а-субъединица РНК-полимеразы состоит из двух независимых г доменов: N-концевого домена (8-235 аминокислотные остатки), который участвует в сборке фермента и С-концевого домена (246-329 аминокислотные остатки), который взаимодействует с UP-элементами промоторов, активаторами и репрессорами транскрипции, а также факторами элонгации (Blatter etal., 1994). С помощью мутационного" анализа были выявлены аминокислотные остатки, участвующие в димеризации N-концевых доменов а-субъединиц, во взаимодействии с р\ р и с-субъединицами фермента. Так аминокислотные замены в положениях 45, 48 и 80 блокируют формирование агР комплексов, а мутации в положениях 86, 173, 180 и 200 препятствуют формированию а;РР комплексов (Igarashi et al.,1991, Kimura and Ishihama,1995). N-домены консервативны и гомологичны у прокариот и эукариот. Так, замена аминокислоты в позиции 40 а-субъединицы дрожжевой РНК-полимеразы II блокирует ее взаимодействие с Р-субъединицей, а замены аминокислот в позициях 40, 41, 44, 45, 54 и 59 а-субъединицы дрожжевых РНК-полимераз I и III приводят к летальному фенотипу (Kolodziej, Young, 1991; Lalo etal., 1993).
Модель трехмерной структуры С-концевого домена а-субъединицы РНК-полимеразы была впервые получена методом ядерного магнитного резонанса (Jeon et al., 1993). Она представляет собой удвоенный модуль спираль-шпилька-спираль (НИН), в котором а-спирали III и IV формируют идеальный модуль HhH, отделенный а-спиралью II от менее совершенного модуля, образованного а-спиралью I и прилегающим к ней фрагментом полипептидной цепи (Shao and Grishin, 2000). Для структурной стабилизации одиночные модули содержат гидрофобные коры. В настоящее время известно, по крайней мере, три других белка, использующих HhH модули для взаимодействия с ДНК. Ими являются: RuvA (Ariyoshi et al., 2000), DNA-полимераза В (Pelletier, et al. 1996 Biochemistry, 35, 12742) и BAF (Umland et al., 2000). Все эти белки взаимодействуют с сахарофосфатным остовом ДНК и не формируют специфических контактов с функциональными группами азотистых оснований.
Молекулярный механизм взаимодействия а-субъединиц с ДНК изучен на нескольких промоторх: rrnBPl, T7D, uxiiAB, lacPl, galPl, XPR (Estrem et al.,1998, Murakami et al.,1996, Gaal et al.,1996; Ozoline et al., 2000,; 2001).
С помощью сайт-направленного мутагенеза в С-концевом домене а-субъединицы РНК-полимеразы были выявлены важные для активации rrnBPJ аминокислотные остатки, Наиболее значимыми оказались Arg-265, Leu-295, Gly-296, Lys-298, Ser-299 (Murakami et al.,1996, Gaal et al.,1996). Эти аминокислотные остатки входят в состав а-спирали I и петли между а-спиралями III и IV, и в случае промотора rrnBPl принимают участие во взаимодействии с ДНК, связываясь с ее малой бороздкой (Jeon et al.,1995; Yasino et al.,2001.; Ross et al.,2001). В полном соответствии с этим, с помощью модификации флуоресцентной меткой цистеинов в С-концевом домене а-субъединиц было обнаружено (Ozoline et al. 2000), что в комплексе с промотором rrnBPl в непосредственной близости от ДНК находятся Cys-269, Cys-271, Cys-272, входящие в состав а-спирали I и Cys-292, входящий в состав а-спирали III. Аминокислотные остатки Arg-265, Leu-295, Gly-296, Lys-298 и Ser-299 оказались важными и для транскрипционной активности промоторов T7D и ыхиАВ (Ozoline et al. 2001), но поблизости от ДНК в этих случаях оказался расположенным С-конец альфа-спирали IV (Ozoline et al. 2000), а аналогичное изменение спектральных характеристик флуоресцентных меток было зарегистрировано вблизи Cys-309 и Cys-283 (а-спирали IV и II соответственно) (Ozoline et al. 2000). Это значит, что способ взаимодействия а-субъединицы с разными промоторами может отличаться. Недавно установлено, что взаимодействующая с rrnBPl поверхность а-субъединицы участвует в димеризации ее С-концевых доменов (Нао Chen et al., материалы конференции FASEB 2001 г., 16). При формировании транскрипционных комплексов с промоторами, не содержащими характерного для rrnBPl UP-элемента С-концевые домены взаимодействуют с ДНК, сохраняя свою димерную форму. Эта димеризация, может сообщать дополнительную стабильность транскрипционному комплексу. Таким образом, важность аминокислотных остатков Arg-265, Leu-295, Gly-296, Lys-298 и Ser-299 для активации T1D и uxiiAB может объясняться их участием в формировании белок-белкового интерфейса.
С помощью различных методов футпринтинга, в том числе сайт-специфического гидролиза ДНК из фиксированного положения на поверхности белка были установлены участки промоторов rmBPl и Т7Д вступающие в контакт с а-субъединицами (Ross et al.,1993, Ozoline et al.,2000, Ross et al.,2001). В rmBPl это богатый АТ-парами участок, содержащий тетрануклеотиды АААА и ТТТТ, расположенные на расстоянии 40-60 н.п. от стартовой точки транскрипции. Структурной особенностью таких треков является сужение малой бороздки ДНК, которое обеспечивает возможность взаимодействия положительно заряженного Arg265, наиболее существенного аминокислотного остатка для активации промотора rrnBPl, с сахарофофатным остовом обеих нитей ДНК или создает конфигурацию, необходимую для взаимодействия с каждым из НЬН модулем (Yasino et al.,2001; Ross et al.,2001). Аналогичные треки находятся в нуклеотидных последовательностях ряда других промоторов, распознаваемых о (кРь, rrnBP2, rrnDPl, HNA2, merT, lac) или альтернативными ст-факторами (Fredric et al.,1995; Giladi et al.,1992; Estrem et al.,1998), но степень гомологии их UP-элементов с rrnBPl не превышает 11 пар (Czarnieck et al.,1997). Важность этих треков для активации rrnBPl была доказана методом случайного мутагенеза последовательности UP-элемента (Estrem et al. 1998, 1999). Наиболее эффективные мутантные производные rrnBPl в участке -57/-47содержали последовательности, имеющие консенсус, а в участке -46/-40. Последовательность дистального сайта у наиболее эффективного производного была, а у проксимального сайта - ААААААА. При этом транскрипционная активность мутантного промотора более чем в 100 раз превышала активность rrnBPl, не содержащего UP-элемента (Estrem et al.,1998). Кроме этих элементов, для максимальной активности промотора rrnBPl важна и более удаленная от стартовой точки транскрипции область, с которой, возможно, взаимодействует одна из о субъединиц РНК-полимеразы в присутствии белка-активатора FIS (Estream et al,1998, Rao etal.,1994).
Зависимость матричных свойств промотора T7D от положения кинкообразующего динуклеотида ТА
Комплексы промотора Т7)..ш со свободными димерами а-субъединицы выявляются методом задержки в геле (Рис. 28), но защита от ДНКазы наблюдается только в области контакта с ближней от элемента -35 а-субъединицей (фосфодиэфирные связи нематричной нити -37/-36 и -40/-39) и в более удаленном от стартовой точки участке (связи -61/-60 и дальше для матричной нити) (Рис. 29). Это значит, что взаимодействие с модифицированным модулем зависит от белок-белковых контактов с остальными субъединицами фермента.
Зависимость функциональных свойств T7D от наличия и локализации «гибких» звеньев и структурообразующих А/Т-треков указывала на целесообразность их учета при моделировании структурной организации промоторов. Такой учет был осуществлен в разработанной в группе регуляторных элементов генома ИБК РАН компьютерной программе PlatProm. Она способна выявлять потенциальные промоторы в нуклеотидных последовательностях используя в качестве критерия вероятностный «показатель подобия». На Рис. 30 показаны результаты сканирования последовательности, прилегающей к промотору T7Z) с учетом «гибких» звеньев и структурообразующих гомонуклеотидных (А)п и (Т)п-треков [В J или без него [А].
В случае T1D минимальная программа, ориентированная на поиск только консенсусных гексануклеотидов и особенностей нуклеотидной последовательности вблизи начала транскрипции, легко обнаруживает настоящую стартовую точку (Рис. 30А). Она входит в кластер других потенциальных точек инициации синтеза РНК, показатель подобия которых ниже. Наличие таких кластеров вблизи настоящих стартовых точек является типичным явлением (Huerta, Collado-Vides, 2004). В большинстве случаев оно отражает вариабельность в расстоянии между точкой старта и элементом -10. В некоторых случаях синтез РНК начинается с каждой из них, но в большинстве случаев он начинается с одной позиции, точность предсказания которой другими алгоритмами не превышает 50%. Для сильного промотора T1D такая проблема отсутствует, так как он содержит оптимальное число консервативных пар 8 из 12. Но, и в этом случае учет дополнительных структурных элементов увеличивает достоверность ее предсказания, так как расчетный показатель подобия становится более чем на 4Std выше случайного уровня.
Для обнаружения многих других промоторов учет этих элементов имеет принципиальное значение. Так, например, промотор modA, имеющий плохо выраженные консервативные элементы вообще не обнаруживается минимальной программой (Рис. 31), а улучшенный алгоритм не только позволяет найти его, но и точно предсказать точку старта. Так, предсказанная этой программой точка инициации транскрипции совпадает с обнаруженным биохимическими методами стартом, а не находится в позициях -55 или +21, рядом с которыми имеются более выраженные элементы -35 и -10 (Рис. 31).
Полученные в данной работе экспериментальные данные предоставляют, таким образом, возможность обосновать позиционный учет кинк-образующих динуклеотидов при моделировании структурной организации промоторов и это является одним из основных результатов проделанных исследований.
На последнем этапе было изучено влияние замены пары G/C на пару Т/А в участке взаимодействия промотора с ближней к элементу -35 а-субьединицей. Это приводит к появлению тандема из двух ТА, но не сопровождается появлением А/Т-трека. Одиннадцать процентов промоторов имеют динуклеотид ТА в позиции -43. Структурное моделирование мутантного промотора свидетельствует об увеличении показателя подобия на 7.5% (для конструкции T7Z).52k, это увеличение составляет 9%), поэтому мы ожидали обнаружить стимулирующий эффект мутации, но анализ матричной активности промотора T7Z) 3k-(Рис. 32) показал ее существенное снижение (на 66,7±0,07%, по сравнению с исходным промотором). Это удивительно, так как в мутантную конструкцию вместо не типичного для UP-элементов гуанина (его содержат только 18% известных промоторов) в позицию -43 был введен тимин, который является одним из наиболее предпочтительных оснований в этом участке (его имеет 31% известных промоторов). Это снижение объясняется явным уменьшением константы ассоциации модифицированного промотора с РНК-полимеразой (в 2.7 раза по сравнению с нативной матрицей) (Рис. 33), а не какими-то более сложными механизмами, действующими на более поздних этапах транскрипционного цикла. Размер локально денатурированного участка вблизи точки старта и динамика синтеза РНК-продуктов для этой матрицы не отличались от нативного промотора. А это значит, что позиционный учет кинк-образующих динуклеотидов в компьютерной программе PlatProm, который существенно увеличил точность предсказания стартовой точки транскрипции, пока не обеспечивает предсказание его функциональных свойств. Аналогично Т7Д\ равновесие между двумя конформерами открытых промоторных комплексов сдвигается в сторону «комплекса 2» (Рис. 33), который полностью разрушается в присутствии гепарина. Это, по-видимому, является результатом повышенной гибкости модифицированного участка, а не изменением угла изгиба двойной спирали, как в случае Т7/)д, так как моделирование трехмерной структуры этого промотора не обнаруживает значительных конформационных изменений (Рис. 26), а профиль энзиматического гидролиза свободного фрагмента свидетельствует об отсутствии фиксированного изгиба ДНК (сравн. Рис. 34 и Рис. 19).
Уменьшение эффективности комплексообразования мутантного промотора с РНК-полимеразой может быть прямым следствием уменьшения способности TlD.43k взаимодействовать с а-субьединицами. Так, данные, полученные методом задержки в геле (Рис. 33) свидетельствуют о неспособности свободных димеров этой субъединицы формировать стабильные комплексы с TlD k, а метод ДНКазного тестирования, аналогично мутантному промотору Т7 д, выявляет слабые контакты хг только с матричной нитью промотора (Рис. 34). Сделанная замена практически не отразилось на профиле энзиматического гидролиза свободного промотора (Рис. 34). Некоторое уменьшение реактивности наблюдается только для фосфодиэфирной связи -44/-45 на нематричной нити. Но контакты с интегрированными в структуру фермента а-субъединицами явно нарушаются. Так, на нематричной нити наблюдается слабая гиперчувствительность для фосфодиэфирной связи -37/-36. Гиперчувствительность в этой позиции для нематричной нити не типична для полимераза-промоторных комплексов (Ozoline, Tsyganov, 1995), но уже наблюдалась в случае мутантной конструкции T7D.s2k (Рис. 29). На матричной нити защищенной оказывается связь -47/-46, которая гиперчувствительна в комплексе с нативным промотором (См. Рис. 8 и 9).
Структурно-функциональная характеристика TlD.32k
Для исследований было создано четыре мутантные конструкции, которые сравнивались с промотором дикого типа по структурным и функциональным свойствам, Вначале, в результате замены АА на ТТ в позициях -45/-44, динуклеотид ТА был заменен на жесткий ТТТТТ трек (конструкция Т7)д), Следующим этапом были замены в позициях —46, -52 и —43, смещающие или вводящие динуклеотид ТА в оптимальные для большинства промоторов позиции -47, -52, -43. Ни одна из замен не оказалась полностью нейтральной, а наиболее существенные изменения обнаружены для конструкций Т7 д и "[7D.4S, функциональные свойства которых оказались существенно нарушенными.
Наиболее информативным методом оказался метод футпринтинга ДНК-белковых комплексов ДНКазой 1, который выявил изменения для всех исследованных конструкций как в свободном состоянии, так и в комплексах с белками. Самое сильное изменение профиля энзиматического гидролиза свободной промоторной ДНК было обнаружено для мутантного промотора Т7 д, в нуклеотидной последовательности которого в результате модификации появился гомонуклеотидный трек ТТТТТ. Появление тетраплета ТТТТ в конструкции 11D.$2k, также как появление AAA в конструкции ТЮок привело только к локальным изменениям конфигурации двойной спирали, а замена G/C-пары в позиции -43 на Т/А, приводящая к появлению третьего динуклеотида ТА в пределах одного витка спирали практически не отразилось на структуре атакуемой ДНКазой малой бороздки ДНК. Это является еще одним свидетельством структурообразующего потенциала гомонуклеотидных А/Т-треков.
Самые незначительные изменения в структуре бинарных комплексов с РНК-полимеразой были зарегистрированы для промотора TIDOK- ОНИ сводятся к небольшому увеличению контакта с белком вблизи модифицированного сайта. Аналогичный сдвиг ТА из позиции -53 в позицию -52 (конструкция T7D„s2k) приводит к сильному увеличению размера контактной поверхности в области взаимодействия дистальной от элемента -35 а-субъединицы, а замены T7DA и Т7). , наоборот, ослабляют контакт с интегрированными в структуру фермента и свободными а-субъединицами.
Методом однократной инициации транскрипции установлен ингибиторный эффект модификаций Т7Ц\ и Т7 _ , первая из которых затрагивает участок, расположенный между местами связывания двух а-субъединиц фермента, а вторая локализуется в участке непосредственного контакта с проксимальной а. В обеих мутантных конструкциях модифицированные участки сохраняют свою позицию относительно взаимодействующих с а-субъединицами модулей. Так, фосфодиэфирные связи, принадлежащие Т/А парам в позициях -45 и -44 полностью доступны для энзиматического гидролиза на обеих нитях, а связь -44/-43, принадлежащая Т/А-паре в конструкции T7ZL« защищена на матричной нити. Таким образом, характерный для высокотемпературного комплекса контакт белка с нативным промотором вблизи позиции -43 сохраняется в комплексах с мутантным промотором.
Перемещение ТА на одну позицию оказывало очень небольшое влияние на матричные свойства промотора. Оно было ингибиторным в случае конструкции TIDOK И активаторным в случае мутации 11D.52- Перемещение ТА из суб-оптимальной (-46) в оптимальную (-47) позицию в спейсере между двумя а-субъединицами (конструкция TIDOK), могла быть нейтральной для функциональных свойств промотора. Она действительно не повлияла на способность Т7 вступать в бинарные комплексы с ферментом, но повлияла на процессивность транскрипции, что, по-видимому и объясняет зарегистрированное снижение количества полноценного продукта. Механизм активаторного проявления мутации HD.sik не до конца понятен. Топология его бинарных комплексов с РНК-полимеразоЙ отличается от комплексов, формируемых нативным промотором большей протяженностью контактной поверхности и наличием явной гиперчувствительности вблизи позиции -37 на нематричной нити. Обе особенности могут быть прямым следствием конформационной подвижности промоторной ДНК. Модифицированный участок остается в непосредственном контакте с ферментом, а это значит, что «гибкие» динуклеотиды могут играть роль не только своеобразных шарниров в промоторной ДНК, но и принимать участие в более селективном взаимодейств ии.
Зависимость комплексообразования от концентрации фермента, исследованная методом задержки в геле, свидетельствует о снижении константы ассоциации только для мутантных конструкции T7D.43 и Т7 д, причем в случае Т7)д это снижение имеет место, несмотря на наличие в его нуклеотидной последовательности пентануклеотида ТТТТТ, являющегося оптимальной мишенью для взаимодействия с а-субъединицами. Уменьшение способности интегрированных в структуру фермента а-субъединиц взаимодействовать с последовательностью, содержащей ТТТТТ-трек, можно объяснить его неоптимальным расположением относительно консервативных элементов, но для свободных димеров а это объяснение несостоятельно, так как формируемые ими контакты не должны зависеть от соседних модулей. Поэтому, существующее представление о том, что гомонуклеотидные А/Т-треки являются идеальными мишенями для взаимодействия с а-субъединицами, по-видимому, нуждается в некоторой корректировке.
Только одна из четырех исследованных мутаций изменяла нуклеотидный состав UP-элемента (T7D.43k), в остальных случаях заменялись оптимальные для этого участка промотора А/Т- или Т/А-пары на Т/А- или А/Т-пары соответственно. Последствия таких замен для специфического взаимодействия РНК-полимеразы с определенными группами оснований должны быть минимальными. Оказалось, что влияние на способность 11D взаимодействовать с РНК-полимеразой (Т7 = Т7 ок = T7 .j2k Т7)д) не коррелирует с длиной вводимых в промотор (Т)п- или (А)п-треков (Т7)д T7Z .j2k TTDOK), НО проявляет близкую к ожидаемой зависимость от наличия и расположения легкодеформируемых динуклеотидов в промоторах.
Таким образом, в работе впервые было исследовано влияние легкодеформируемых звеньев промоторной ДНК на структурно-функциональные свойства транскрипционных комплексов. Установлено, что удаление «гибкого» динуклеотида ТА из участка, не вступающего в непосредственный контакт с сс-субъединицами РНК-полимеразы влияет на архитектуру пол имераза- промотор ного комплекса и его функциональные свойства. Установлено, что в результате этой модификации нарушается контакт не только с интегрированными в фермент а-субъединицами, но и со свободными димерами этих субъединиц. Обнаружено, что перемещение этого динуклеотида ТА на одну позицию от стартовой точки приводит к незначительным конформационным изменениям двойной спирали ДНК, не изменяет способность промотора T7D взаимодействовать с РНК-полимеразой, но влияет на синтез РНК. Показано, что «гибкие» динуклеотиды могут выполнять не только адаптивную функцию, но и напрямую взаимодействовать с а-субъединицами. Установлено, что присутствие мотива ТАТА в участке взаимодействия промотора с ближней к элементу -35 а-субъединицей снижает способность РНК-полимеразы и свободных димеров а взаимодействовать с промотором и ингибирует синтез РНК. Результаты работы указывают на целесообразность учета структурообразующих элементов при создании обобщенной модели промотора, что повышает точность предсказания стартовых точек транскрипции.
