Введение к работе
-Актуальность теш дкосергяцки. Сайт-направленный мугстенез яв-пяется одним из наиболее эффективных методов введения направленных замен в последовательность ДНК при реконструкции генетического материала, а также получения белков с направленными изменениями в амшсккслот'юй последовательности. Разработка новых и оптимизация /же существующих методов мутагенеза позволяет более эффективно про-зодать" реконструкцию ДЬ'К и получать информацию о структуряо-фуніщи-эпальных отношениях в белках.
Исследование стру^турно-функционажьных отнсзеній в уридинфос-орилазе позволяет виявить участки белковой глобулы, определяющие іззриентвтивяую активность в этом ферменте. Эти данные, кроме фундаментальных- знаний о1 пршщппаг функционирования урцпзвфосйорилазы, зозваллют..целєнаправлеішо создавать соединения, 'кнгійирукпще активность этого белка. Последнее особенно актуально в связи с резким лзелшчеяием уровня биосинтеза уридквфосфорзиазн в раковых клетках. Г.о. понимание принципов футщионирования уридпнфосфорилазы ведет к созданию .высокоэффективных химиотерапевтических агентов для лечения онкологических заболеваний. .
Сказанное вше и определяет актуальность темы исследования.
%2rs рзбши. Целью работы. являлась оптимизация сайт-направленного мутагенеза ДНК с применением полимеразнои цепной реакции и исследование с помощью.предложенных методов структурно-функцнонадь-ек отношений в уридинфосфорилазе.- ферменте катаболизма нукдеозк-зсв в Е.соИ.
Научгля позкзва работы. При проведении-исследования предложены новые подходы к сайт-направленной реконструкции ДНК, позволяющие іроводить протяженные изменения в первичной аминокислотной последо-зателъности белков. Отработана методика введеній точечных замен в аминокислотной последовательности белков с применением полимеразнои' депной реакции. С использованием этих- подходов существенно упроща-этся поиск функционально-важных фрагментов и отдельных аминокислотных, остатков в белковой молекуле.
Впервые применено сочетание, введения спонтанных мутаций в сое--гав структурной -части гена .уридинфосфорилазн (обработка ДНК бисуль-|мтом натрия..in vitro) с доследующим-.отбором мутантних форм фермента in vivo (выращивание культуры влрисутствии 5-фтор-2'-дезоксиу-эддина). Показано, что использование данного подхода в сочетании с >. зодимеразной цепной реакцией позволяет эффективно .изучить роль отдельных аминокислотных остатков в функпионироваяші белка.
Создан экспргссионный вектор, в составе которого клонирован гибридный ген тимидинфосфорилазы E.coli под контролем промоторной области уридинфосфорилазы из E.coli. Показано, что данная конструкция обеспечивает высокий уровень (до 48% от общеклеточных белков) экспрессии гибридного гена в Е. coli.
Сконструирован рекомбинантный акцессионный вектор, содержа- . щий синтетический ген эглина С - ингибитора нротеиназ. Показано, . что созданная конструкция обеспечивает высокий уровень биосинтеза белка в условиях- тетерологианой экспрессии. Получен штамм-продуцент соответствующего белка, позволяющий-нарабатывать не'менее 0,4 г/л Эглина С. Сконструированный штамм может использоваться для наработки препаративных количеств.полипептида, имеющего высокий терапевтический эффект при лечении воспалительных процессов.
Получении изучен ряд мутантных форм уридинфосфорилазы из Е. coll. Показано, что в белке отсутствуют как внутри-, так к межмолекулярные дисульфидные связи. Выявлена определяющая роль СузІЗб з формировании белковой глобулы и возможное его участие в образованші активного центра фермента. Исследована функциональная роль остатков гистидинов в проявлении белком ферментативной активности. Показано, что только Н122 участвует в поддержании (формировании) активного центра фермента. Показано, что участок Р61-Р72 выполняет важную функциональную роль в ферменте, участвуя в связывании-ионов фосфа- -та. Показано, что N- и С-концевые фрагменты уридинфосфорилазы играют, важную роль в формировании активной четвертичной структуры фермента.
Праістічесіїая ценность работа. Создан экспрессионный вектор, обеспечивающий высокоэффективную траскршіцию и трансляцию генов. На основе вектора сконструирован штамм-продуцент тимидинфосфорилазы кз Е. coll, обеспечивающий экспрессию целевого фермента до 0,8 г на литр куіштуральной жидкости. Создание- штамма-продуцента позволяет выделять препаративные количества белка и использовать его для ферментативного синтеза производных деаокгятирыидинов, широко-применяющихся в химиотерапии онкологических заболеваний.
Создан штаам-продуцент высокоспецифического ингибитора протеи-наз - Эглин С, обеспечивающего уровень биосинтеза белка не менее 0,4 г/л куіштуральной згадкости. ' -
С использованием полимеразной цепной реакции разработаны новые подходы к сайт-направленной реконструкции ДНК, позволяющие существенно упростить получение как точечных, так и протяженных му-
таций в составе белков.
Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов,и методов исследования, изложения собственных результатов и их обсуждения, еыводов и списка -литературы. Объем диссертации составляет 139 страниц основного текста, а такке 26 рисунков и 2 таблиц.