Содержание к диссертации
Введение
1. Основные положения и структура диссертации 4
1.1. Основные положения, выносимые на защиту 4
1.2. Основные публикации по теме диссертации 7
1.3. Научная новизна и значение материалов и основных полонсений диссертации 10
1.4. Структура диссертации 12
1.5. Список сокращений 13
2. Использование молекулярных признаков в филогенетике 14
2.1. Необходимость независимых методов филогснетики 14
2.2. Элементы сконструированного дерева 21
2.2. Разнообразие методов молекулярной филогенетики 24
2.3.1. Дистанционные (матричные) методы 27
2.3.2. Метод максимальной экономии 32
2.3.3. Метод минимальной эволюции 35
2.3.4. Методы максимального правдоподобия 36
2.3.5. Другие методы построения дерева 48
2.3.6. Учет степени вариабельности сайтов 39
2.3.7. Практика сравнения методов построения дерева 44
2.4. Оценка «достоверности» филогенетических гипотез 45
2.5. Трудности молекулярной филогенетики 57
2.5.1. Выравнивание 65
2.5.2. Недостаток филогенетически информативных признаков 70
2.5.3. Проблема притяжения длинных ветвей 71
2.5.3.1. Обнаружение длинных ветвей и регистрация эффекта их притяжения 74
2.5.3.2. Причины появления длинных ветвей 76
2.5.3.3. Подходы к разрешению проблемы притяжения длинных ветвей 85
2.6. Перспективы молекулярных методов филогенетики 92
3. Элементы макромолекул как филогенетические маркеры 94
3.1. Признаки крупных таксонов не подчиняются простым правилам «нейтральной эволюции» 94
3.2. Кладистический анализ молекулярных сипапоморфий как способ размещения «длинных ветвей» на филогенетическом дереве 95
3.3. Признаки с переменной скоростью эволюции 96
3.4. Градуалыюсть возникновения дискретных состояний 102
3.5. Закон Долло для макромолекул 110
3.6. Природа и филогенетическое значение признаков с переменной скоростью эволюции 116
3.7. Вариабельные области рРНК как хранилище маркерных признаков 119
3.8. Аксиоматика кладистического анализа 120
4. Общая часть 128
4.1. Спираль 3 130
4.2. Спирали 6, 7, 8 132
4.3. Вариабельная область V2 134
4.3.1. Трансверсии в области шпилька E10 l Bilateria 137
4.3.2. Ипсерции во внутренней петле шпильки Е10 1. Модификации шпильки Е10 1 у Deuterostomia: Ambulacraria 145
4.4. Вариабельная область V3 150
4.4.1. Область V3 микроспоридий 156
4.4.2. Область V3 Heterolobosea 161
4.4.3. Преобразование спирали 17 у Bilateria 161
4.4.4. Особенности области V3 Mesozoa и Myxozoa 169
4.5. Гипервариабельная область V4 186
4.6. Спирали 24 и 25: примеры гомоплазий 190
4.7. Спираль 30 201
4.8. Петли шпилек 35 и 48 202
4.9. Спирали 42, 43,44. Гипервариабельная область V7 203
4.10. Спираль 49. Гипервариабелыгая область V9 205
5. Систематическая часть 208
5.1. Общая характеристика внешней группы Metazoa 208
5.1.1. Концепция "Archezoa" 210
5.1.2. Укоренение дерева эвкариотов и форма крист ближайшего общего предка. 217
5.1.3. Alveolata 219
5.1.4. "Chromista" и "Chromalveolata" 228
5.1.5. Ближайшие родственники Metazoa 233
5.2. Монофилия Metazoa 238
5.3. Монофилия Bilateria 245
5.4. «Низшие» Metazoa и сестринская группа Bilateria 246
5.5. Положение на филогенетическом дереве Placozoa, Mesozoa, Myxozoa 255
5.6. Основные группы Bilateria 261
5.7. Начальная радиация Bilateria 263
5.8. Lophotrochozoa: легкость выделения, трудности подразделения и интерпретации 263
5.9. Концепция Ecdysozoa против Articulata 274
5.10. Эволюция Arthropoda 275
5.10.1. Оценка гипотезы монофилии Mandibulata 277
5.10.2. Клады насекомых, распознаваемые по вторичной структуре V7 282
5.11. Филогения круглых червей (Nematoda) 286
5.11.1. «Низшие» Chromadoria 289
5.11.2. Высшие Chromadoria 292
5.11.3. Поляризация признаков Dorylaimia 297
Выводы 309
- Основные публикации по теме диссертации
- Разнообразие методов молекулярной филогенетики
- Кладистический анализ молекулярных сипапоморфий как способ размещения «длинных ветвей» на филогенетическом дереве
- Монофилия Metazoa
Введение к работе
Предметом настоящего исследования является сравнение РНК малой субъединицы рибосом с целью построения филогенетического дерева. Важнейшая задача, возникающая при взгляде на рРНК как на инструмент филогенетических реконструкций - выяснение структурных особенностей и закономерностей эволюции рРНК, влияющих на результат построения дерева (по первичной или предсказанной вторичной структуре), выяснение возможных причин отличий сконструированного дерева от истинного (т. е. дерева, отражающего действительные родственные отношения видов), выработка способов обнаружения таких отличий и путей их преодоления.
Путем сравнения большого числа первичных и предсказанных вторичных структур рРНК малой субъединицы эвкариотов, извлеченных из баз данных или определенных экспериментально, обосновываются следующие положения о структуре и эволюции рРПК, которые выносятся на защиту.
Основные публикации по теме диссертации
Основные положения, выносимые на защиту, были доложены на ряде отечественных и между народных конференций и обоснованы в следующих публикациях в отечественных и международных реферируемых журналах. 1. Владычепская Н.С., Кедрова О.С, Милютина И.А., Окштейи И.Л., Алёшин В.В., Петров Н.Б. 1995. Положение типа Placozoa в системе многоклеточных животных по результатам сравнения последовательностей гена 185 рРНК // Докл. Академии наук. Т. 344. №. 1.С. 1-3. 2. Алёшин В.В., Владычепская Н.С., Кедрова О.С, Милютина И.А., Петров Н.Б. 1995. Сравнение генов 18S рибосомной РНК в филогении беспозвоночных // Молекуляр. биология. Т. 29. № 6. С. 1408-1426. 3. Алёшин В.В., Владычепская Н.С., Кедрова О.С, Милютина И.А., Петров Н.Б. 1998. Элементы вторичной структуры 18S рРНК свидетельствуют о происхождении двустороннесимметричных животных от Cnidaria // Молекуляр. биология. Т. 32. № 2. С. 359-360. 4. Aleskin V.V., Kedrova O.S., Milyutina LA., Vladychenskaya N.S., PetrovN.B. 1998. Secondary structure of some elements of 18S rRNA suggests that strongylid and a part of rhabditid nematodes are monophyletic // FEBS Letters. V. 429. № 1. P. 4-8. 5. Aleshin V.V., Kedrova O.S., Milyutina LA., Vladychenskaya N.S., Petrov N.B. 1998. Relationships among nematodes based on the analysis of 18S rRNA gene sequences: molecular evidence for monophyly of chromadorian and secernentean nematodes II Russ. J. Nematol. V. 6. № 2. P. 175-184. 6. Aleshin V.V., MilyutinaLA., Kedrova O.S., VladychenskayaN.S., PetrovN.B. 1998. Phylogeny of Nematoda and Ccphalorhyncha derived from 18S rDNA//J, Мої. Evol. V. 47. №5. P. 597-605. 7. Алёшин B.B., Владычепская H.C, Кедрова О.С, Милютина И.А., Петров Н.Б. 1999. Вторичная структура шпильки 17 низшего многоклеточного животного Rhopahtra ophiocomae (Mesozoa: Orthonectida) как пример "прерываемого равновесия" в эволюции 18S рибосомной РНК // Молекуляр. биология. Т. 33. № 2. С. 319-329. 8. Aleshin V. V„ PetrovN.B. 1999. Implicaciones del gen 18S ARNr en la evolucien у filogenia de los Arthropoda II Evolucion у Filogenia de Arthropoda I Eds. Melic A., De Haro J.J., Mendez M., Ribera I. II Boletin de la S.E.A. № 26. P. 177-196. 9. Milyutina LA., Aleshin V.V., Mikrjukov К A., Kedrova O.S., PetrovN.B. 2001. The unusually long small subunit ribosomal RNA gene found in amitochondriate amoeboflagellate Pelomyxapalustris: its rRNA predicted secondary structure and phylogenetic implication // Gene. V. 272. № 1-2. P. 131-139. 10. Русин Л.Ю., Алёшин В.В., Владычепская H.C, Милютина И.А., Кедрова О.С, Петров Н.Б. 2001.
Первичная структура петель 35 и 48 малой рРНК свидетельствует, что Trefusiidae являются субтаксоном морских Enoplida (Nematoda) II Молекуляр. биология. Т. 35. № 5. С. 912-919. 11. Алёшин В.В., Петров Н.Б. 2001. Регресс в эволюции многоклеточных животных // Природа. № 7. 62-70. 12. Алёшин В.В., Петров Н.Б. 2002. Молекулярные свидетельства регресса в эволюции многоклеточных животных//Жури. общ. биологии. 63. №3. С. 195-208. 13. Петров Н.Б., Алёшин В.В. 2002. Условно-нейтральные филогенетические признаки крупных таксонов - новый аспект эволюции макромолекул // Генетика. Т. 38. № 8. С. 1043-1062. 14.Kuvardina O.N., LeanderB.S., Aleshin V.V., MyVnikovA.P., KeelingPJ., Simdyanov T.G. 2002. The phylogeny of colpodellids (Alveolata) using small subunit rRNA gene sequences suggests they are the free-living sister group to apicomplexans II J. Eukaryot. Microbiol. V. 49. № 6. P. 498-504. \5.Nikolaev S.I., Berney C, FahrnU., Mylnikov A. P., Aleshin V.V., PetrovN.B., Pawlowski J. 2003. Gymnophrys cometa and Lecythium sp. are core Cercozoa: evolutionary implications II Acta Protozoologica. V. 42. № 3. P. 183-190. 16.Leander B.S., Kuvardina O.N., Aleshin V.V., Myl nikov A. P., Keeling P.J. 2003. The free-living ancestry of apicomplexans: phylogeny of colpodellids (Alveolata) as inferred from small subunit rDNA // J. Eukaryot. Microbiol. V. 50. № 5. P. 334-340. 17. Rusin L. Y., Aleshin V. V., Tchesunov A. V., Atrashkevich G.I. 2003. The 18S ribosomal RNA gene of Soboliphyme baturini Petrow, 1930 (Nematoda: Dioctophymida) and its implications for phylogenetic relationships within Dorylaimia//Nematology. V. 5. №4. P. 615-628. 18. Алёшин В.В., Петров Н.Б. 2003. Условно нейтральные признаки // Природа. № 12. С. 25-34. 19. Алёшин В.В, 2004. Примитивно ли вариабельное дробление Enoplida (Nematoda)? Замечание к статье Д,А. Воронова «Сравнительная эмбриология нематод и закон зародышевого сходства»//Журн. общ. биологии. Т. 65. № 1. С. 74-81. 20.Manylov O.G., Vladychenskaya N.S., Milyutina LA., Kedrova O.S., Korokhov N.P., Dvoryanchikov G.A., Aleshin V, V„ Petrov N.B. 2004. Analysis of 18S rRNA gene sequences suggests significant molecular differences between Macrodasyida and Chaetonotida (Gastrotricha) // Мої. Phylogenet. Evol. V.30. № 3. P. 850-854. 21. Nikolaev S.I., BerneyC, FahrniJ.F., Bolivar I., PoletS., Mylnikov A.P., Aleshin V.V., Petrov N.B., Pawlowski J. 2004a. The twilight of Heliozoa and rise of Rhizaria, an emerging supergroup of amoeboid eukaryotes//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V, 101. №21. P. 8066-8071. 22. Pegova A.N., Krasnova E.D., Aleshin V. V. 2004, Evidence from the small and large ribosomal RNA structure suggests that Anoplostoma rectospiculum Gal tsova, 1976 (Nematoda: Anoplostomatidae) is a member of superfamily Enoploidea, not Oncholaimoidea 11 Nematology. V. 6.№ 3. P. 413-422. 23. Nikolaev S.I., Mylnikov A.P., Berney G, Fahrni J.F., Pawlowski J., Aleshin V. V., Petrov N.B. 2004b. Molecular phylogenetic analysis place Pecrolomonas cosmopolhus within Heterolobosea: Evolutionary implications//J. Eukaryot, Microbiol. V. 51. № 5. P. 575-581. 24. Алёшин B.B., Константинова А.В., Никитин M.A., Окштейн И.Л. 2004. О генетическом однообразии рода Trichoplax (Placozoa) II Генетика. Т. 40. № 12. С. 1714-1716. 25.Алёшин В.В., Мыльников А.П., Петров Н.Б. 2005.
Дерево корненожек // Природа. № 8. С. 40-46; там же, № 9. С. 65-72. I Выдвигаемые положения обоснованы сравнением как определенных нами экспериментально, так и большого числа опубликованных в доступных электронных базах последовательностей рРНК, Экспериментально определено более 40 почти полных последовательностей гена рРНК малой субъединицы, многие из которых принадлежат видам, занимающим ключевое положение на филогенетическом дереве. Оригинальные данные охватывают 19 типов многоклеточных (губки (Porifera), пластинчатые (Placozoa), Orthonectida, брюхоресничные черви (Gastrotricha), колючеголовые черви (Acanthocephala), приапулиды (Priapulida), Kinorhyncha, круглые черви (Ncmatoda), волосатики (Ncmatomorpha), членистоногие (Arthropoda), Kamptozoa) и одноклеточных (воротиичковые жгутиконосцы (Choanoflagellata), микроспоридии (Microspora), споровики (Sporozoa), церкомоподы (Rhizaria), криптофитовые (Cryptophyta), центрохелидные солнечники (Centrohelida), лобозные амебы (Amoebozoa), гетеролобозпые (Hetcrolobosea)). Полный список экспериментально определенных последовательностей приведен в разделе «Материал и методы» (Табл. 6). Множественное выравнивание последовательностей и их структурный анализ основаны как на предложенных ранее моделях вторичной структуры, так и скорректированных в настоящей работе. В частности, все модели в «Общей части» представлены оригинальными рисунками, построенными с учетом допущешш, перечисленных в тексте диссертации. Полученные в работе последовательности использованы в разработках таких важных вопросов филогенетики беспозвоночных, как установление родственных отношений одноклеточных эвкариотов, в частности, амебоидных организмов, поиск сестринской группы многоклеточных животных, определение положения низших Metazoa (Placozoa, Mesozoa), разрешение базальной радиации в типах круглых червей и членистоногих и разработке других вопросов. Их вклад играет решающую роль в разрешении крупномасштабной филогении Nematoda. Новизна представляемых результатов не ограничивается только новыми экспериментальными данными, но и включает разработку новых подходов к сравнению последовательностей, в частности, адаптацию к молекулярным признакам кладистических принципов В. Хешшга- наиболее мощного эвристического метода в филогепетике.
Разнообразие методов молекулярной филогенетики
Сконструированное дерево может совпадать, а может и не совпадать с истинным. Тут, конечно, не может быть никой речи о плюрализме: задача филогенетики состоит в получении в конце концов того единственного сконструированного дерева, которое не отличается от истинного. Причины же расхождений могут быть самые разные - от несовершенства теоретических положений и ошибок правил вывода до ошибок видовых аннотаций последовательностей в базах данных. Ложные деревья рано или поздно распознаются по несогласию их предсказаний о составе монофилетических групп и распределению признаков (предполагаемому и наблюдаемому) на множестве видов. Косвенной проверкой филогенетических гипотез служит распределение признаков, неизвестных в момент выдвижения гипотез (например, иуклеотидных последовательностей генов), в том числе на множестве вновь описанных видов. Например, филогенетическая интерпретация традиционной гипотезы Articulata сталкивается с фактом отсутствия какого-то преимущественного сходства в рРНК малой субъединицы кольчецов и членистоногих. Альтернативная гипотеза Ecdysozoa (сформулированная на данных сравнения первичных структур рРНК малой субъединицы) пока не сталкивается с явными и бесспорными противоречиями ее предсказаний при сравнении генов больших рРНК и некоторых других макромолекул ограниченного числа таксонов многоклеточных животных. Проверка сконструированных деревьев связана также с развитием представлений о закономерностях эволюции морфологических, молекулярных и других признаков (гипотез о возможности независимого возникновения рассматриваемых признаков) и, накоиец, с критикой методов построения и оценки дерева. В методологическом плане филогенетика не отличается от других научных дисциплин: у нее есть объективный предмет исследования, так же не наблюдаемый прямо, как и предмет исследования других наук (физики, химии, астрономии), и открытый критике актуалистический инструмент познания. Мнение о принципиальной невозможности установления истинной эволюции ввиду невозможности наблюдать прошлое, основано на недоразумении.
Самые строгие критики не решатся на бытовом уровне отрицать принципиальную возможность реконструкции недавнего прошлого: охотником по следам зверя, судом по заключению криминалиста, медведем по пустой чашке. Конечно, недостаток следов и неправильная их интерпретация являются источниками непреднамеренных ошибок таких реконструкций. В приложениях, выделившихся из общего потока сравнений нуклеиновых кислот, надежность методов идентификации личности, определения отцовства, паспортизации сортов и пород попадает под пристальное внимание общества или эти методы законодательно регламентируются. Несмотря на относительную прозрачность методов филогенетических реконструкций по молекулярным данным (Li, 1997), они не обходятся без серьезных и подчас скрытых проблем. Внешним их проявлением является создание не одной, а множества компьютерных программ построения деревьев и постоянно меняющиеся требования к таким программам, вычислительная сложность которых растет параллельно повышению возможностей вычислительной техники. В настоящее время число не просто разработанных, а более или менее широко используемых филогенетических программ и целых пакетов превысило сотню и продолжает увеличиваться. Список с кратким описанием и электронными адресами наиболее популярных из них доступен по адресу http://evolution.genetics.washington.edu/phyIip/felsenstein.html. Методы построения деревьев, реализованные в них, основаны на различных принципах. Условно их можно разделить на четыре группы (хотя это деление будет неполным). К первой группе относятся дистанционные (матричные) методы, воплощающие адансоновскис принципы классификации. Они включают два независимых и обязательных этапа. На первом этапе тем или другим способом количественно оценивают сходство между последовательностями. Эта задача не такая тривиальная, как может показаться на первый взгляд. Для РНК или белков обычно устанавливают, какие остатки в двух последовательностях совпадают, а какие различаются. Для этого необходимо предварительно каким-то способом установить позиционную гомологию остатков, то есть провести так называемое «выравнивание» последовательностей (см.: Li, 1997; Уотермеп, 1999). Более подробно эта задача рассматривается ниже. Это как бы «нулевой» этап. Пока примем без обсуждения, что позиционная гомология остатков установлена (т. е. правильное выравнивание сделано или кем-то дано). Далее необходимо вычислить показатель сходства.
Простейшая мера сходства -процент совпадающих (или процент различающихся) остатков. Ее использовали только в самых первых работах по сравнению макромолекул, а теперь она считается плохой мерой генетического расстояния: две случайные нуклеотидные последовательности, при одинаковой частоте нуклеотидов каждого типа в них1, будут сходны на 25%. Простейшая модель Джукса и Кантора (JC) предусматривает коррекцию на это «случайное» сходство, из-за которого недоучитываются обратные мутации. Она рассматривает мутационный процесс как равновероятное замещение нуклеотида при независимой эволюции на любой из четырех, причем замещение на три других приводит к потере сходства (Jukes, Cantor, 1969). В результате доля идентичных оснований q переводится в расстояние К по формуле К = 3/4 In[3/(4q-l)]. Естественно, генетическое расстояние К оказывается больше доли различающихся оснований (І-q), что корректирует до некоторой степени расчетным образом обратные мутации (чем меньше похожи последовательности, тем большая поправка вносится). По мере снижения сходства к 25% количество расчетных мутаций начинает многократно превосходить наблюдаемые различия между последовательностями (дистанции по Джуксу и Кантору сильно возрастают), а по достижении 75% различий (и больше) программа выдает сообщение об ошибке. Более сложные модели молекулярной эволюции, например, двухпараметрическая модель М. Кимуры (К2Р), Дж. Фельзенштейпа (F81) или модель HKY, учитывают неодинаковую вероятность трапзиций и трансверсий (несовпадению пуриповый нуклеотид - пиримидиновый нуклеотид присваивается большее значение, чем несовпадению двух пуриновых или двух пиримидиновых нуклеотидов), отклонения от равенства нуклеотидпого состава в последовательностях или то и другое одновременно (Kimura, 1980; Felsenstein, 1981; Hasegawa et al., 1985). Могут быть использованы и более сложные модели, учитывающие нуклеотидный состав конкретных сайтов выравнивания (Manskc, Chapman, 1987), различную вероятности перехода между любыми пуклеотидами (а не только разницу между транзициям и трансверсиями) и другие параметры. Таким образом, из одних и тех же фактических данных - нуклеотидных последовательностей -может быть получено несколько альтернативных выравниваний, а по каждому выраиниванию может быть получено большое число численно различающихся наборов парных генетических расстояний. Конкретный набор всех парных расстояний между ОТЕ Если в одной из последовательностей некий нуклеотид встречается с частотой больше 0,25, и такая же повышенная частота этого нуклеотида свойственна другой, негомологичной последовательности, то случайное совпадение этих нуклеотидов ожидается больше чем в 25% позиций. Аналогично, если негомологичные последовательности в целом отличаются по нуклеотидному составу, их случайное сходство будет меньше 25%, и то совпадение, которое считалось бы неслучайным при равенстве нуклеотидпого состава, может достоверно не отличаться от случайного по статистическим критериям. называют матрицей .
Кладистический анализ молекулярных сипапоморфий как способ размещения «длинных ветвей» на филогенетическом дереве
Своеобразные отличия первичной или предсказываемой вторичной структуры макромолекулы (signatures) позволяет идентифицировать представителей того или другого таксона (Fox, Wocse, 1975; Woese et al., 1985; Mannella et al., 1987; Michot et al,, 1990; Winker, Woese, 1991; Fell et al., 1992; Cavalier-Smith ct al., 1994), а если эти признаки удается поляризовать, то есть установить, какое состояние является эволюционной инновацией (сииапоморфий по кладистической терминологии), молекулярные признаки могут служить объектом кладистического анализа и оказаться способом преодоления рассмотренных выше затруднений молекулярной филогенетики (James et al., 1988; Wolters, Erdmann, 1988; Pace et al., 1989; Wheeler, 1989; Алёшин и др., 1995,1999; Rokas, Holland, 2000; Петров, Алёшин, 2002). Наличие специфических признаков (сииапоморфий) в анализируемой последовательности указывает па ее принадлежность к определенной кладе, даже если многочисленные замещения в вариабельных областях не позволяют с определенностью установить ее положение на дереве вследствие артефактов, вызванных притяжением "длинных ветвей" или недостатком филогенетически информативных признаков. Общеизвестным примером таксоноспецифических признаков являются различия эвкариотических, эвбактер и ал ышх и архебактериальных рРНК (Winker, Woese, 1991) с той, однако, поправкой, что в этом случае неизвестно, какое состояние предковое, а какое апоморфиое. Подобные макромолекулярные признаки могут быть входными данными для программ "молекулярной морфометрии" (Billoud et al., 2000). Хотя их выбор весьма трудно формализовать, использование таких особенно показательных признаков для филогенетического анализа представляет собой по сути предельный случай взвешивания участков макромолекулы по признаку эволюционной консервативности, который стал не только принятой, но скорее обязательной процедурой в современной практике компьютерного построения филогенетических деревьев. Процедура верификации топологии дерева по отдельным признакам может быть подвергнута критике, но она оправдана по нескольким причинам. Во-первых, прямым подсчетом установлено, что таксоны высокого ранга могут сохранить очень небольшое число сииапоморфий. Например, у нематод отряда Enoplida в пределах гена 18S рРНК сохраняется всего лишь два специфичных нуклеотида (по одному в петлях шпилек 35 и 48), если не принимать в расчет случайные совпадения в гипервариабельных областях (Русин и др., 2001).
Во-вторых, консервативные замены или дискретные состояния отдельных элементов вторичной структуры рРНК бывают весьма устойчивы в пределах групп разного таксономического ранга. Устойчивость рассматриваемых элементов наблюдается даже в линиях с аномально высокой скоростью эволюции гена 18S рРНК. Например, генетические расстояния, измеренные по полным последовательностям гена 18S рРНК внутри нематод рода Pelodera (Nematoda, Rhabditida), превышают обычные расстояния между различными типами беспозвоночных животных. Так, генетическое расстояние между 18S рРНК P. sirongyloides и P. teres превышает (по дереву1) таковое между генами нематоды Enoplus brevis (Nematoda, Enoplida) и медузы Atolla vanhoeffeni (номера последовательностей в GenBank U13932, AF083002, U88336, AF100942 соответственно) более чем в 3 раза (Рис. 15). Тем не менее в рРНК малой субъединицы Р. strongyloides присутствуют структурные элементы, специфичные для Nematoda, например, симметричная в апикальной части спираль 17 (Aleshin et al., 1998а), и многие другие, в том числе специфические, в частности, для Rhabditida и отдельных субтаксонов Rhabditida. Таким образом, отдельные элементы вторичной структуры могут быть хорошими филогенетическими маркерами, особенно полезными для определения положения видов с быстро эволюционирующими последовательностями. Примеры таких маркеров приведены ниже. И, наконец, кладистический анализ не зависит от априорных моделей фиксации мутаций. Наиболее распространенные модели молекулярной эволюции, предусматривающие постоянную скорость замещений, удовлетворительно описывают широкий класс нейтральных событий, например, замещений в гипервариабельных частях макромолекул, но мало пригодны для описания эволюции адаптивных или условно нейтральных признаков с переменной скоростью фиксации, находящихся под прессом функциональных ограничений (Fitch, Markowitz, 1970; Fitch, 1971; Miyamoto, Fitch, 1995; Tuffley, Steel, 1998; Алёшин и др., 1999; Felsenstein, 2001; Galtier, 2001; Penny et al, 2001; Huelsenbeck, 2002; Kondrashov et al., 2002). Между тем, эти признаки имеют первостепенное значение для решения филогенетических вопросов, касающихся древних филогенетических линий (типов, классов). 3,3, Признаки с переменной скоростью эволюции В рРНК малой субъединицы, как любой макромолекуле, выполняющей функции фермента, некоторые остатки или их блоки, соответствующие функциональным активным центрам, эволюциоипо консервативны, почти неизменны у всех живых существ. Например, среди множества известных последовательностей прокариотов или эвкариотов почти неизменна нуклеотидная последовательность вблизи спирали 49, входящая в 1 Разница в расстояниях по матрице близка к указанной для дерева изменены без утраты функции рибосомы, но это происходит так редко, что их изменчивость не была обнаружена на выборке 1993 г.: она видна только на нынешней выборке.
В этих случаях не составляет труда распознать плезиоморфпое состояние: оно массово представлено во всех основных таксонах, и апоморфпое состояние - то, которое наблюдается у отдельных видов или групп в составе тех же таксонов, где встречается также и плезиоморфпое состояние. Например, мы исследовали распределение на филогенетическом дереве двух относительно редких мутаций: транзиции A- G1195 в петеле 35 и трансверсии G- T1601 в петеле шпильки 48 (нумерация остатков по гену 18S рРНК Enoplus brevis, номер документа в GenBank U88336) (Рис. 9, 16). Эти нуклеотиды входят в состав Р-сайта рибосомы или приближены к нему (Carter et al., 2000). Указанные замены фиксированы на выборке из более двухсот известных последовательностей 18S рРНК нематод соответственно один и два раза и представляют собой наиболее надежные синапоморфии отряда Enoplida в пределах 18S рРНК с наименьшей степенью гомоплазии (Русин и др., 2001). Среди примерно четырехсот проверенных последовательностей насекомых такие же замены обнаружены у двух неродственных видов (сверчка и короеда). Примерно с такой же частотой, как среди нематод и насекомых (полпроцента «на кладогенез»), эти замены обнаруживаются и в других сегментах базы рРНК, включающих виды остальных многоклеточных животных, грибов, высших растений и одноклеточных эвкариотов. Очевидно, так вычисленные частоты не имеют ничего общего со средними частотами или соотношениями транзиции и трансверсий по всему гену, используемыми для измерения генетических дистанций между последовательностями. Интереспо, что фиксация одной из указанных мутаций повышает «вероятность» фиксации другой, так что обычно более редкий признак G1195 присутствует одновременно с признаком Т1601 (Русин и др., 2001). Наконец, в рРНК существуют вариабельные участки, скорость эволюции которых, измеренная при определенных теоретических допущениях, в 7000 раз превышает скорость эволюции консервативных (но не инвариантных) сайтов (Van de Peer et al., 1996a). Однако полагать, что эти усредненные скорости для сайтов оставались постоянными в истории рРНК, было бы чересчур строгим требованием, даже несмотря на предполагаемую их неизменную функциональную роль.
Монофилия Metazoa
Практически любой современный таксон за историю систематики подвергался неоднократным ревизиям, изменявшим его объем и ранг. Не является исключением и наибольший таксон, рассматриваемый в зоологии - царство животных. Еще Аристотель заметил трудность классификации прикрепленных и малоподвижных животных, в которых кажется смешанной животная и растительная природа, и которые вплоть до середины XIX в. в различных системах составляли искусственный таксон Zoophyta . Определения животных как жизненной формы (Мирабдуллаев, 1992) приводят к включению в их состав одноклеточных с фаготрофным питанием и исключению некоторых паразитических Metazoa. Мы станем рассматривать животных просто как наибольший по объему монофилетическнй таксон многоклеточных в филогенетической системе. Линпевские Algae содержали зеленые водоросли, печеночный мох Marchantia, фукус, губки и кораллы, а линневский отряд Zoophyta наряду с кишечнополостными, иглокожими, головоногими моллюсками оключал и одноклеточных (род Chaos), Животные в таком составе не были монофилетичны. Позднее Э. Геккель объединял губок с одноклеточными и монерами (бактериями) в царство Protista. Впоследствии идея об обособленном положении губок находила поддержку в концепции извращения зародышевых листков или, в недавнее время, в наличии ультраструктурных отличий губок от остальных Metazoa, В качестве аргумента в пользу независимого происхождения губок от хоанофлагеллят, кроме воротничка, казывали сходство корешковых систем их жгутика, лишенного (в большистве типов клеток губок) исчерченного корешка, обычного для Metazoa. В разные годы ставился под сомнение вопрос о принадлежности к животным тех или иных классов "типа" Mesozoa, который изначально создавался для форм, кажущихся переходными от одноклеточных к многоклеточным. Некоторые представители "Mesozoa" в действительности оказались многоклеточными динофитовыми. Остатки "Mesozoa" в виде Rhombozoa, Orthonectida и Trichoplax теперь обычно рассматривают в составе Metazoa (Иванов, 1968; Малахов, 1990), хотя предположения о протозойной природе Rhombozoa изредка высказывают до сих пор (Noto, Endoh, 2004).
Наметившаяся сейчас существенная стабилизация представлений об объеме Metazoa как монофилстического таксона во многом обязана информации о генах рРНК малой субъедипицы, которая позволяет с большой определенностью провести разграничение между Metazoa и другими Opisthokonta. Самые первые попытки, однако, привели авторов первых работ к ошибочному выводу о независимом происхождении «двуслойных» и «трехслойных» (двусторонпесимметричных) животных от одноклеточных предков (Field et al., 1988). Эта ошибка была вызвана тем, что рРНК «двуслойных» (представленных в первых работах кишечнополостными), меньше отличались от последовательностей, принадлежащих внешней группе (одноклеточным), чем рРНК «трехслойных» (Рис. 67). То же обнаружилось и для рРНК большой субъединицы, причем «двуслойные» были представлены частичными (около 300 п. и.) последовательностями 28S рРНК кишечнополостных, гребневиков, губок и Trichoplax (Christen et al., 1991; Lafay et al,, 1992). Этот артефакт притяжения длинных ветвей, вызванный повышенной скоростью эволюции рРНК в стволовой линии Bilatria, вскоре был устранен вычислительными методами, такими как модификация MP (Lake, 1990) или ML (Wainright et al., 1993), в том числе примененными к тому же самому выравниванию, на основании которого дистанционные методы разъединяли «двуслойных» и «трехслойных» (Lake, 1990). К началу широкого применения молекулярных данных для филогенетического анализа одним из актуальных вопросов была проверка гипотезы происхождения губок от воротничковых жгутиконосцев независимо от остальных Metazoa. Как только стали доступны для анализа первые почти полные последователыюсти 18S рРНК Demospongiae, Calcarea и воротничковых жгутиконосцев, эта гипотеза была отвергнута в пользу гипотезы монофнлии Eumetazoa и губок (Wainright et al., 1993; Алёшин и др., 1995). Позднее принадлежность к Metazoa была подтверждена для стеклянных губок (Hcxactinellida). Этот результат не изменился при увеличении выборки сравниваемых видов, в том числе включении в анализ последовательностей ранее неизвестных одноклеточных Opisthokonta, таких как Mesomycetozoea и Ministeria, и при использовании генов рРНК большой субъединицы (Medina et al., 2001). Анализ нуклеотидных последовательностей гена 18S рРНК подтвердил принадлежность к Metazoa Trichoplax, Rhombozoa и Orthonectida, которые, ввиду их несомненного положения в кроне дерева Metazoa, должны рассматриваться как морфологически упрощенные формы (для обзора см.: Алёшин, Петров, 2002).
Это же справедливо и в отношении миксоспорндий (Myxozoa), которые на деревьях рРНК также располагаются в кроне Metazoa и, следовательно, превратились из многоклеточных в протистов (по уровню организации). Филогенетические аспекты проблемы положения Myxozoa рассмотрены ниже. Строго говоря, установленный молекулярными методами факт монофилии губок и остальных Metazoa означает только отсутствие современных протистов (кроме миксоспорндий), более родственных какому-то современному типу многоклеточных. Тем не менее, оц делает более экономным предположение, что мпогоклеточность Metazoa унаследована от ближайшего общего предка, а не возникла в разных типах независимо. Степень экономности возрастет, если будут выявлены дополнительные черты сходства в молекулярных механизмах развития губок и остальных Metazoa. Это весьма вероятно в свете обнаружения у губок генов, ортологичных генам, управляющих развитием позвоночных и членистоногих, таких как представители семейства Нох, которые не встречаются за пределами Metazoa. Уточнение филогении ближайших родственников Metazoa - «одноклеточных» в целом, и особенно Opisthokonta, также влияет на предполагаемое число эволюционных событий и, следовательно, на предполагаемое правдоподобие эволюционных реконструкций. Традиционные гипотезы происхождения Metazoa пытаются решить два вопроса: возникновение многоклеточности и возникновение клеточной дифференцировки. По Э. Геккелю, первоначально возникла многоклеточная Бластея из однородных клеток, которая, испытав гаструляцию, превратилась в двуслойный организм - Гастрею. В XIX в. сведения о разнообразии клеточного состава низших Metazoa были весьма неполными, а набор протистов, используемых как модели перехода от одноклеточпости к мпогоклеточности, был ограничен колониальными зелеными водорослями и воротичнковыми жгутиконостцами. Надо заметить, что для воротничковых жгутиконосцев, которых рассматривали как ближайших родственников Metazoa, типичны упрощенные жизненные циклы с однообразными вегетативными клетками и цистами покоя. Воротничковые со сложным жизненным циклом, такие как Proterospongia, хотя и были открыты, оставались недостаточно изученными. В настоящее время ситуация изменилась. С одной стороны, теперь не вызывает сомнения большое разнообразие типов клеток современных губок и кишечнополостных, особенно если рассматривать не отдельные их виды, а таксоны в целом . По этой причине они не очень подходят на роль примитивных двуслойных предков Metazoa. Группы с наиболее простой морфологией и клеточным составом (Trichoplax, Rhombozoa) тем более пе подходят на роль «живых предков», поскольку являются вторично упрощенными. С другой стороны, теперь пе вызывает сомнения сложность жизненных циклов большинства таксонов «одноклеточных». Как правило, они включают несколько различных типов вегетативных клеток, нередко специализированные генеративные клетки, покоящиеся стадии.
