Введение к работе
Актуальность проблемы. Начиная с середины текущего столетия в связи с внедрением достижений биологической науки в практику здравоохранения произошли существенные изменения в структуре заболеваний человека. Изменился спектр инфекционных заболеваний за счет широкого применения антибиотиков и вакцинации населения против наиболее опасных микроорганизмов, возросла доля внутренних болезней и аутоиммунных заболеваний, обусловленных нарушением нормальных физиологических процессов, протекающих в человеческом организме. Томимо сложностей, возникающих в процессе лечения таких больных, зесьма затруднительна диагностика внутренних болезней, особенно іревентивная диагностика, так как клиническая картина болезни наблюдается при уже значительных поражениях органов и тканей.
Одной из основных задач клинической биохимии является поиск новых гуморальных маркеров для дифференциальной диагностики различных заболеваний внутренних органов, прогнозирования тяжести течения іатологического процесса и возможности развития осложнений. Такого эода маркерами могут служить антитела, вырабатываемые к наиболее іммуногенньїм белкам органов и тканей. Являясь по сути вторичными на іервьіх стадиях патологического процесса, эти аутоантитела могут играть гущественную роль в процессе развития поздних осложнений, а значит, югут служить гуморальными маркерами последних.
Представляемое исследование является частью общей научной работы, іроводимой в лаборатории молекулярной эндокринологии індокринологического Научного Центра РАМН. Основным направлением этих гсследований является выявление наиболее иммуногенных белков, жспрессируемых клетками инсулиномы человека, создание их іактериальньїх продуцентов и разработка методов тестирования
-4-аутоантител при использовании рекомбинантных белков в качесті антигена. Объектом исследований была выбрана секретирующая инсулиноь человека, из ткани которой сконструирована клонотека кДНК экспрессируицем плазмидном векторе pUEXl и выделена суммарная фракци экспрессируемых белков.
Цель и задачи исследования. Целью представляемой диссертационно работы было создание бактериального продуцента антигенной детерминант панкреатической холестеролэстеразы человека и разработка на его основ методов тестирования антител с использованием существующей клонотек кДНК из инсулиномы человека.
Конкретными задачами исследования являлись:
получение иммунологически активной антисыворотки морской свинки суммарным белкам инсулиномы человека, содержащей антитела панкреатической холестеролэстеразе;
проведение с помощью последней иммуноскрининга клонотеки кДНК и: инсулиномы человека в экспрессируицем плазмидном векторе pUEXl і выявление иммунопозитивных рекомбинантных клонов; идентификаци: иммунопозитивных белков;
установление локализации антигенной детерминанты в структурі иммунопозитивного фрагмента панкреатической холестеролэстеразы, используя методы молекулярного клонирования, секвенирования і иммуноферментного анализа;
выделение гибридных белков, вырабатываемых созданными генно-инженерными продуцентами;
использование рекомбинантных белков в качестве антигена в разработке лабораторного варианта твердофазного иммуноферментного методе выявления антител к панкреатической холестеролэстеразе в сыворотке человека и морской свинки;
> проведение скрининга больных с различными нарушениями функции поджелудочной железы с целью выявления у них аутоантител к панкреатической холестеролэстеразе человека и установления корреляции с определенными видами патологии.
Научная новизна работы заключается в изучении некоторых свойств :равнительно нового объекта, недавно описанного фермента поджелудочной селезы человека - панкреатической холестеролэстеразы (пХЭ.
Новым является изучение природы иммуногенности пХЭ человека. В >езультате проведенных экспериментов показана локализация антигенной ;етерминанты пХЭ в области пролин-богатых повторов типа PVPPTGDSGAP, и 'аким образом, однознсчно установлена одна из функций этой уникальной іелковой структуры.
Впервые разработан лабораторный вариант иммуноферментного метода ыявления антител к пХЭ человека в сыворотках человека и морской винки. Проведенная клиническая апробация этого метода способствовала ыяснению возможной роли фермента пХЭ человека в развитии кистозного оражения ткани поджелудочной железы.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и обсуждены а расширенном межлабораторном заседании Института экспериментальной ндокринологии ЭНЦ РАМН (Москва, 1998), на научной конференции, освященной 80-летию академика Н.А. Юдаева (Москва, 1993), на Третьем еждународном симпозиуме по биоорганической химии (Дагомыс, 1995), на ретьем Российском съезде эндокринологов (Москва, 1996) и на X еждународном конгрессе по эндокринологии (Сан Франциско, 1996).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ и одна дана в печать.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 8 6 траницах машинописного текста; состоит из введения, обзора итературы, экспериментальной части, включающей материалы и методы
исследования, результаты исследования и их обсуждение, заключения выводов. Работа иллюстрирована 4 таблицами и 15 рисункамі библиографический указатель включает 74 публикаций, в том числе - < зарубежных авторов.
Вклад соавторов отражен в публикациях по теме диссертации. Bet коллегам автор приносит благодарность за участие в совместной работе.