Введение к работе
Актуальность проблемы
Развитие техники молекулярного клонироввния и быстрого секзе-пироввнпя нуклеиновых кислот привело к накоплении огромных по объему баз данных, содержавши нуклзотидные и аминокислотные последовательности десятков тысяч генов и белков. Поскольку биохимическое описание белков осуществлялось прежними темпами, число неоха-рактерпзованных белковых последовательностей неуклонно увеличивалось. В результате в качестве самостоятельной отрасли гдалекулярной биологии стали развиваться теоретические методу обработки биологической инфорлацип. Применение этих методов позволяет делать пред--сказания о функциях белков на основе сравнительного анализа их аминокислотных последовательностей, что значительно ускоряет и облегчает биохимические исследования.
Процесс репликация - один из центральных процессов клеточной шзнедеятелыгостп, благодаря ему осуществляется передача генетической информации потомству. С момента возникновения молекулярной биологии решшкативныэ бели - объект ее изучения, В настоящее врем, когда о репликативных процессах накоплен значительный объем биохимических данных, настала очередь детальных исследований структурно-функциональных аспектов каталитической активности ропликативных белков, отражающих как общие', так и особенные черты строения и функциональной активности аналогичных белков из разных организмов. Проведение такого рода исследования требует изучения аминокислотных последовательностей участвупдих в репликация белков. Цель исследования
Основной целью данного исследования было функциональное картирование т. е. установление функций отдельных белков, домо-тов.' или аминокислотных остатков репликативных белков бактерий, фагов и
вирусов с помощью методов сравнительного анализа аминокислотных последовательностей.
Конкретные задачи исследованния сводились к следующему:
1. Провести сравнительный анализ последовательностей праймаз п
взаимодействующих с ними хеликаз, в том числе локализовать прай-
назный и хеликазный домены в белке gp4 фага Т7, и прайнрзный домен
в бифункциональном белке Ра фага Р4.
-
Провести сравнительный анализ и выявить консервативные ыотивы в последовательностях сайт-специфических эндонуклеаз икосаэдрических бактериофагов, инициирующих репликацию по типу катящегося кольца. Провести поиск описанных мотивов в последовательностях плазмидных п вирусных белков, точно или предположительно принимающих участие в инициации репликации по типу катящегося кольца.
-
Провести сравнительный анализ последовательностей плазмидных, Фаговых и вирусных эндонуклеаз с одноцепочочными вндонуклеазами системы переноса плазмядной ДНК из клетки-хозяина в бактерии и растительные клетки.
-
Предсказать возмокные функции описанных консервативных мотивов. Научная новизна работы
Впервые с помощью сраыштельного анализа установлены функционально-важные участки и отдельные аминокислоты в последовательностях праймаз бактерий, бактериофагов, вирусов. Идентифицировав! праймазные домены в бифункциональных белках бактериофагов Т7, ТЗ і Р4. На основе анализа первичной структуры известнь"э на сегодня 2С последовательностей праймаз разделены на 4 различные группы. Взаимодействующие с праймазами хеликазы также составляют 4 группы, по составу соответствующие праймазным.
Описаны консервативные мотивы в последовательностях сайт-специфических эндонуклеаз, инициирующих репликацию по типу катящегося
кольца у икосаэдричэских бактериофагов и одяоцепочечных плазмид грачполоаителышх бактерий. Описанные мотивы шявлеїш в последовательностях белков NS1 парвовирусов, аы гекиниЕирусов, что позволило картировать домены с вндопуклеазной активностью в этих полифункциональпых белках.
Предсказан способ репликации и идентифицированы участвующие в инициации репликации белки для вируса анемии цыплят, вируса гниения листьев кокоса, плазмид архебактерий и актияомицетов.
Установление сходства мезду последовательностями репликатпв-нш белков вирусов, плазмид н бактерий позволяет распарить представления об эволюционных связях этих организмов. Практическая ценность работы
Проведенные исследования по идентификации функционально-вак-ных участков в последовательностях белков, участвущих в инициации репликации, дают основу для детального изучения структурных аспектов каталитической активности указанных белков с помощью экспериментальных методов, в частности путем сайт-специфического мутагенеза.
Предсказание способа репликации для малоизученных вирусных репликонов позволяет исследователям рационально организовать дальнейшие исследования этих объектов. Основные полокения, выносимые на защиту:
-
На основе сходства аминокислотных последовательностей известные на сегодняшний день белки с праймазной активностью разделены на 4 группы. Показано, что хеликазы, взаимодействующие с праймазами в процессе репликации, такге образуют 4 группы по составу соответствующие праймазным.
-
С помощью сравнительного анализа установлено, что в бифункцио-.' налышх белках gp4 фагов ТЗ и 17 и Ра фага' Р4 праймазный домен
составляет 244 и 299 аминокислотных остатка с N-конца соответственно. Проведенный анализ последовательностей однокомпонентних и двукомпонентных праймаз/хеликазных систем бактерий и бактериофагов свидетельствует в пользу их общего происхождения.
-
Полученные с помощью теоретического анализа неохарактернзован-шх биохимически аминокислотных последовательностей вируса анемии цыплят САА, вируса гниения листьев кокоса ctdv, вируса спироплазмы SPV4. плазмид архебактерий и актиномицетов данные свидетельствуют о их возможной репликации по типу катящегося кольца.
-
В результате сравнительного анализа аминокислотных последовательностей сайт-специфических эндонуклеаз, инициирующих репликацию по типу катящегося кольца у икосаэдрических бактериофагов и одно-цепочечннх плазмид грамполонителышх бактерий, описаны характерныэ для зтих ферментов мотивы и установлены функционально-вашшэ аминокислотные остатки.
б. Характерные эндонуклеазше мотивы обнаружены в последовательностях аы геминивирусов и NS1 парвовирусов, что позволило картировать домены, участвующие в инициации репликации вирусного генома. Описанные мотивы также найдены в последовательностях сайт-специфичвских ондонуклвь-j, участвующих в переносе ДНК в процессе конъюгации бактерий. Апробация работы.
Материалы диссертации были изложены на I советско-германском симпозиуме по структурным аспектам ДНК-белкового взаимодействия (С.-Петербург, 1991), конкурсе научных работ молодых , ученых Института микробиологии РАН (Москва, 1991, 1992). Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 3 работы. Объем и структура работы.
Диссертация включает введение, главы "обзор литературы", "материалы и метода", "результати п их обсуждение" п вывода. Работа изложена на tIV страницах машинописного текста и содержит 22 рисунка, 2 таблицы и список цитированной литературы из 247 наименований.