Содержание к диссертации
СОДЕРЖАНИЕ 2
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 6
ГЛАВА I. МЕЛИОИДОЗ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
Введение 8
Эпидемиология мелиоидоза 9
Бактерии вида В. pseudomallei, как этиологические агенты мелиоидоза 10
2.1 Классификация и филогенез 10
Экологические особенности вида 14
Краткая характеристика молекулярных основ патогенеза при мелиоидозе 17
Популяционное разнообразие В. pseudomallei.... 20
Особенности организации генетического аппарата В. pseudomallei в сравнении с В. mallei. 22_
Факторы вирулентности В. pseudomallei 27
Механизмы устойчивости к активным формам кислорода 27
Системы секреции 29
Экзополисахариды 30
Соединения, обладающие цитопатическим эффектом 31
Флагеллы, пили 32
Адгезины 34
Устойчивость к антимикробным препаратам 35
3. Диагностика мелиоидоза 36
Исследования серологического статуса... 37
Бактериологические методы исследований 38
Иммуногистохимические методы 38
Биохимические тесты , 40
Полимеразная цепная реакция 40
Комбинированные методы исследований 42
Методы молекулярного типирования бактерий вида В. pseudomallei 43
Заключение 46
ГЛАВА II. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 47
Введение 47
Выбор экспериментальных объектов 48
Вычитающая гибридизация 49
Библиотека фрагментов ДНК, отличающих геном В. pseudomallei С-141 от В. mallei С-5 52
Сравнительный анализ с последовательностями, депонированными в базах данных 54
Функции генов, представленных дифференциальными последовательностями ДНК 57
Мобильные элементы и гены бактериофагов 57
Регуляторы транскрипционной активности генов 65
3.2,3. Гены, кодирующие ферменты биосинтеза поверхностных полисахаридов 65
Гены, кодирующие ферменты цикла мочевины 66
Гены, кодирующие ферменты внерибосомного биосинтеза пептидов 67
Другие гены 67
4. Библиотека фрагментов ДНК, отличающих геном В. mallei С-5 от S. pseudomallei С-141 68
Сопоставление последовательностей дифференциальных фрагментов с последовательностями, депонированными в базах данных 70
Функции генов, соответствующих фрагментам ДНК, присутствующим в В. mallei С-5, но не в В. pseucfomafle/С-141 71
Гены, кодирующие белки клеточной адгезии 72
Гены, кодирующие транспортные белки и компоненты транспортных систем 76
Мобильные элементы, гены бактериофагов и плазмидные гены 80
Множество фрагментов ДНК, отличающих геномы В. pseudomallei С-141 и В. mallei С-5, сходны с геномными островами штамма В. pseudoamllei К96243 81
Исследование генетического полиморфизма бактерий видов В. mallei» В. pseudomallei 85
Применение последовательностей ДНК, полученных вычитающей гибридизацией, для
генотипирования бактерий видов В. pseudomallei и В. mallei 99
Заключение 102
ГЛАВА III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 106
1. Материалы 106
1.1 Оборудование 106
Буферы, солевые растворы 106
Химические реактивы 108
Готовые наборы реактивов 109
Препараты, меченые радиоактивными изотопами 109
Ферменты 109
Олигонуклеотиды 109
Микробиологические среды 109
Антибиотики 110
Компетентные бактерии 111
Препараты геномных ДНК 111
2. Методы 111
Выделение бактериальных геномных ДНК 111
Вычитающая гибридизация 112
Создание библиотек клонов 125
Дифференциальный скрининг 129
Подтверадєние дифференциальной природы плазмидных вставок методом Саузерн-блот гибридизации 131
Подтверждение дифференциальной природы плазмидных вставок методом ПЦР 133
Определение первичной структуры плазмидных вставок.. 134
Гибридизация геномных ДНК штаммов В. pseudomallei и В. mallei с ДНК эрреем 134
Биоинформационный анализ 136
2.10. Статистический анализ 139
ВЫВОДЫ 142
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 144
БЛАГОДАРНОСТИ 171
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
В Г - вычитающая гибридизация
ед - единица
г - грамм (мг, миллиграмм; мкг, микрограмм; нг, нанограмм)
л - литр (мл, миллилитр; мкл, микролитр)
М - моль (мМ, миллимоль; мкМ, микромоль; пМ, пикомоль)
дНТФ - 2',3'-дидезоксирибонуклеозид-5'-трифосфат
ДНК - дезоксирибопуклеиновая кислота
рРНК - рибосомная рибонуклеиновая кислота
тРНК - транспортная рибонуклеиновая кислота
ГО - геномный остров
ИЛ - интерлейкин
ИНФ - интерферон
НФА - иммуноферментный анализ
ЛПС - липополисахарид
ОРФ - открытая рамка считывания
ОП - островок патогешюсти
по - пара оснований
ПААГ - полиакриламидпый гель
ГГГЭФ - пульс гель электрофорез
ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов
ПЦР - полимеразная цепная реакция
RAPD - random amplified polymorphic DNA
ELISA - епгуте-І inked immuno sorbent Assay
ФНО - фактор некроза опухолей
Введение к работе
Burkholderia mallei, В. pseudomallei и В. thailandensis представляют собой три филогенетически близких вида грамотрицательных бактерий. Первые два вида являются возбудителями опасных заболеваний человека и непарнокопытных животных - сапа и мелиоидоза, соответственно, тогда как В. thailandensis, будучи близким родственником первых двух видов, слабо вирулентен даже для особо чувствительных лабораторных животных.
В национальных системах классификации патогенных микроорганизмов России, Великобритании, США и Канады, возбудители сапа и мелиоидоза отпесепы к ведущим группам по степени опасности, которую они потенциально представляют для человека, В частности, по данным экспертов, В. mallei и В. pseudomallei являются возможными агентами для биологического терроризма. Проблема осложняется тем, что на сегодняшний день не существует лицензированных вакцин для профилактики мелиоидоза. Создание профилактических препаратов сильно затруднено недостаточной изученностью состава поверхностных антигенов В. pseudomallei и отсутствием детальных представлений о механизмах взаимодействия патогенов с клеточными и гуморальными звеньями иммунной системы хозяйского организма.
Несмотря на опасность, которую представляют собой эти микроорганизмы, возрастающую еще и вследствие их устойчивости к широкому кругу антибиотиков, до настоящего времени отсутствуют детальные представления на молекулярном уровне о факторах и механизмах, ответственных за формирование их вирулентных свойств. В частности, открытым остается вопрос о том, почему на уровне экологии и эпидемиологии В. mallei и В. pseudomallei сильно отличаются как друг от друга, так и от непатогенного В. thailandensis, тогда как на генетическом и иммунологическом уровнях многие из их характеристик совпадают. Более того, несмотря на многочисленные исследования, также остается открытым вопрос о степени, причинах и следствиях природной вариабельности этих видов бактерий, вплоть до неопределенности в таксономической дифференциации В. mallei и В. pseudomallei. Тогда как общепринято, что В. thailandensis является очень близким, но, тем не менее, отдельным видом, высокое сходство В. mallei и В. pseudomallei
на генетическом и иммунологическом уровнях приводит к тому, что некоторые исследователи считают В. mallei вариантом В. pseudomallei. Как следствие, высокая внутривидовая генетическая вариабельность и перекрывание генных и антигенных свойств В, mallei и В. pseudomallei приводят к серьезным проблемам в идентификации и дифференциальной диагностике инфекционных агентов.
Первым шагом к решению перечисленных выше фундаментальных и прикладных проблем является определение различий в организации геномов бактерий близкородственных видов В. mallei и В. pseudomallei. Большой стимул для подобного рода работ ожидается от расшифровки и сопоставления полно геномных последовательностей, которая уже осуществлена для двух представителей видов В. pseudomallei и В. mallei, штаммов К96243 и АТСС23344, соответственно. Однако, полученные последовательности дают информацию только о двух штаммах из большого разнообразия природных популяций и не могут дать исчерпывающей эволгоциошю-популяционной картины, необходимой для выводов о функциональных свойствах. Последовательности геномов представляют, тем не менее, необходимые стандарты с которыми можно проводить сравнение остальных штаммов и изолятов с тем, чтобы делать выводы о присутствующих или отсутствующих в них последовательностей, по сравнению со стандартами.
Одним из перспективных методов сравнительного полногеномного анализа, не зависящего от доступности информации по последовательности геномов, является вычитающая гибридизация, которая дает возможность идентифицировать различия между бактериальными штаммами и, таким образом, создавать структурную основу для выявления причинно-следственной связи между генотипической вариабельностью и фепотипическими характеристиками бактерий, в частности, их патогенностью и эпидемиологическими особенностями.
Целью настоящей диссертационной работы являлось изучение различий в организации геномных ДНК двух представителей видов В. mallei и В. pseudomallei, штаммов С-5 и С-141, соответственно, методом вычитающей гибридизации и использование полученных различий для анализа генетического полиморфизма этих
бактериальных видов. Работа проводилась совместно с Лабораторией особо опасных инфекций Государственного научного центра прикладной микробиологии (п. Оболенск),
