Введение к работе
Актуальность проблемы.
Гетерохроматические районы составляют в ряде случаев более 50% эука-риотического генома. Несмотря на это, молекулярно-генетический портрет гетерохроматина начинает складываться только сейчас. Становится очевидным, что гете-рохроматин содержит ряд специфических генетических локусов, столь же важных, как и эухроматические. Одна из существенных особенностей организации гетерохроматина - это сильная обогащенность повторами, которые могут определять транскрипционную активность гетерохроматических генов. Большая часть повторяющихся элементов гетерохроматина собрана в тандемные кластеры, в которые инкорпорированы многочисленные мобильные элементы. Наиболее изученными компонентами гетерохроматина D.melanogaster являются кластер рибосомальных генов (рДНК) и сателлитные ДНК (сат-ДНК). Однако остаются открытыми вопросы, касающиеся молекулярных механизмов эволюции и поддержания в геноме гетерохроматических тандемных повторов (в том числе рДНК и сат-ДНК). В гетеро-хроматине X хромосомы обнаружены тандемные повторы Stellate, кодирующие белок, сходный с регуляторной субъединицей протеинкиназы СКП. Особенности дивергенции/гомогенизации повторов гетерохроматина, кодирующих белок, никем не исследовались, поэтому представляло интерес выяснить степень внутригеном-ного полиморфизма генов Stellate на молекулярном уровне, принимая во внимание, что закономерности их эволюции могут определяться селективным давлением. Данные об особенностях полиморфизма повторов на уровне* определения нук-леотидных последовательностей, особенно в отношении кластера прерываемого вставками, представляет особый интерес для понимания закономерностей эволюции тандемных повторов.
Отдельный аспект в изучении гетерохроматина составляет эффект положения (ЭП) мозаичного типа, заключающийся в мозаичной экспрессии эухроматиче-ских генов, перемещенных к гетерохроматической ДНК. Исследования ЭП продвинулись в основном в плане изучения транс-действующих белковых факторов, модифицирующих действие гетерохроматических блоков на эухроматические гены. Вопрос о природе и специфичности цис-действующих гетерохроматических элементов изучен крайне недостаточно. Представляло интерес подойти к исследованию этого вопроса, используя изученный нами на молекулярном уровне протяженный фрагмент гетерохроматина Х-хромосомы.
Цели и задачи исследования.
Задача работы состояла в описании молекулярной структуры фрагмента гетерохроматина Х-хромосомы, содержащего кластер генов Stellate, кодирующих белок, сходный с Р-субъединицей протеинкиназы CK1I. С целью изучения особенностей молекулярной эволюции тандемных повторов (гомогенизации) необходимо было выяснить уровень полиморфизма повторов Stellate внутри тандемного кластера, сравнивая близлежащие и удаленные гены, интактные и поврежденные вставками. Специальный интерес представлял анализ обнаруженных рядом с генами Stellate фрагментов рДНК, их сравнение с функционирующими генами рДНК. Это могло пролить свет на природу молекулярных процессов, обеспечивающих идентичность повторов рДНК.
С помощью трансформации мух с использованием Р-элемента, представляло интерес исследовать способность фрагментов кластера генов Stellate вызывать эффект положения мозаичного типа.
Новизна результатов исследования.
Показано наличие в гетерохроматине прерываемого вставками тандемного кластера кодирующих белок генов Stellate (с интактными ОРТ), эволюция которых шла под давлением отбора. Показано, что степень дивергенции повторов возрастает с увеличением расстояния между ними, а вставки препятствуют «гомогенизации» повторов. На примере псевдогенов рДНК показано существова-
ниє множественных рекомбинационных актов сегментной конверсии, происходящих в гетерохроматине между генами и псевдогенами рДНК. Клонирован и секве-нирован новый ретротранспозон, содержащий длинные концевые повторы (ДКП). Показано, что он сильно амплифнцирован в геномах видов группы D.melanogaster и D.yakuba, а у группы видов D.virilis представлен уникальной последовательностью на гаплоидный геном.
Впервые с помощью трансформации на основе Р-элемента показано, что клонированный фрагмент гетерохроматина известной структуры способен вызывать эффект положения эухроматического гена.
Апробация работы.
Работа апробирована на лабораторном семинаре в отделе молекулярной генетики животных (ОМГЖ) ИМГ РАН и на кафедре Молекулярной биологии в МГУ им. М. В. Ломоносова. Данные, представленные в работе, доложены на пяти международных конференциях.
Публикации.
По материалам работы опубликованы две статьи в международных журналах, данные представлены на 5 конференциях.
Структура и объем диссертации.