Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы б
1.1. Повторы эу кар йот и сателлитиая ДНК (сатДНК) 6
1.2. Структура сатДНК 7
1.3. Роль сатДНК в геноме эукариот 9
1.3.1. Особенности структуры сатДНК и их функциональное значение 11
1.4. Эволюция сатДНК 13
1.4.1. Модели эволюции повторов 13
1.4.2. Молекулярные механизмы эволюции сатДНК 17
1.4.3. Эволюционная динамика сатДНК 19
1.5. Молекулярные маркеры в филогенетических исследованиях 20
1.5.1. Филогенетическое значение сатДНК 22
1.6. Сетчатая эволюция. Ее значение для видообразования в животном царстве 27
1.6.1. Сетчатое видообразование у позвоночных 29
1.6.2. Исследования сетчатого видообразования у пресмыкающихся 32
1.7. Систематика сем. Lacertidae 35
1.7.1. Филогеография и филогения семейства Lacertidae 35
1.7.2. Происхождение и филогения группы видов «комплекса L. agilis» = род Lacerta s. str,, Linneus, 1758 36
1.7.3. Происхождение и филогения Кавказких скальных ящериц рода Darevskia, Arribas 1999 = «комплекс Lacerta saxicola», (Lacertidae) 37
2. Материалы и методы исследования 42
2.1. Биологический материал. 42
2.2. Выделение геномной ДНК. 42
2.3. Клонирование мономеров сатДНК в плазмидном векторе. 44
2.4. Секвенирование. 45
2.5. Гибридизация геномной ДНК с зондами сатДНК. 46
2.6. Компьютерная обработка данных. 47
3. Результаты и обсуждение 48
3.1 СатДНК ящериц рода DAREVSKIA, Arribas 1999 (Sauria: Lacertidae) 49
3.1.1. Характеристика семейства CLsat сатДНК 50
3.1.2. Организация повторяющейся единицы CLsat: внутренняя структура и консервативные элементы нуклеотидной последовательности 61
3.1.3. Молекулярные механизмы, участвующие в эволюции семейства CLsat 63
3.1.4. Сравнительный анализ вариабельности нуклеотидной последовательности мономеров четырех подсемейств CLsat и скорость их эволюции. 66
3.1.5. Организация семейства повторов CLsat 71
3.1.5.1. Динамика видоизменения организации повторов семейства CLsat 71
3.1.5.2. Динамика количественного распределения трех подсемейств CLsat у видов рода Darevskia 1А
3.1.6. Корреляция филогении сатДНК CLsat и филогении видов Darevskia. 78
3.1.7. Сетчатая эволюция партеногенетических видов рода Darevskia на примере CLsat-ДНК 85
3.2- СатДНК видов «комплекса L. AGILISv>= LA СЕКТА S. STR, Linneaus 1758 (Sauria: Lacertidae) 95
3.2.1. Характеристика Agil60 семейства сатДНК 96
3.2.2. Вариабельность и организация Agil60 последовательностей 99
3.2.3. Анализ структуры семейства повторов Agil60 сатДНК с помощью гибридизаци 102
3.3. Сравнительный анализ сатДНК ящериц двух родов семейства Lacertidae 106
3.3.1. Сравнение повторов CLsat и Agil60 и вероятный путь происхождения сатДНК ящериц родов Darevskia и Lacerta s. str. 107
3.4. Филогенетическое значение сатДНК для семейства Lacertidae 114
Выводы 117
Список литературы 118
- Особенности структуры сатДНК и их функциональное значение
- Сетчатая эволюция. Ее значение для видообразования в животном царстве
- Клонирование мономеров сатДНК в плазмидном векторе.
- Молекулярные механизмы, участвующие в эволюции семейства CLsat
Введение к работе
За время, прошедшее с момента открытия повторяющихся регионов ДНК, накопилась огромная литература, посвященная изучению их структуры и свойства в разных таксонах, однако интерес к проблеме в последние годы только возрастает (1 - 3 Kidwell, 2002; Boot-Handford, Tuckwell, 2003; Korochkin, Ryskov, 2003). Стало очевидным, что повторяемость участков генома есть общее и значимое явление, в той или иной степени свойственное многим структурным, кодирующим белки, генам и генам рибосомпых и транспортных РНК (4-6 Sidow, 1996; Gogarten, Olendzenski, 1999; Taylor et al., 2001). Это явление играет важную роль в эволюции функциональных возможностей эукариот и, тем самым, в развитии их адаптивного потенциала (1,6-8 Wajcman, Kjger, 2002; Pires-daSUva, Sommer, 2003).
Однако наиболее поразительный и до сих пор неразгаданный феномен, характеризующий геномную ДНК, - это наличие в ней некодирующих повторяющихся участков, разнообразие которых по последовательности, размерам и локализации поистине неисчерпаемо, а функция остается непонятой и прямо не доказанной (9 Гречко, 2002). К повторам такого рода относят так называемые сателлитные ДНК (сатДНК), открытые в виде дополнительных пиков при изучении плавучей плотности ДНК в градиенте солей цезия (10 Sueoka,Cheng, 1961; Kit, 1961). Сейчас этот термин используется для всех высокоповторяющихся тандемных повторов, независимо от их плавучей плотности (11,12 Charlesworth, 1994; Ugarkovic, Plohl, 2002). Эти фракции содержат непрерывные ряды (тандемные кластеры) одинаковых или сходных по структуре мономерных единиц размером от нескольких единиц до тысяч нуклео-тидов, число которых в ряду может достигать сотен тысяч (9, 11 - 13 Beridze, 1986). К повторам относят также рассеянью по геному в виде единичных копий участки ДНК (SINE, LINE, транспозоны) значение и функция которых также активно обсуждается (14 Shedlock, Okada, 2000).
Эволюционная направленность и функциональная значимость тандемных повторов ДНК интенсивно изучаются, в частности, у беспозвоночных и млекопитающих, но в гораздо меньшей степени у других таксонов. При этом, данные об эволюции и структуре повторяющейся ДНК у столь широкого класса позвоночных как рептилии представлены весьма небольшим числом работ (16 Capriglione, 2000). В основном, это работы по исследованию диспергированных повторов у змей, черепах, тандемных повторов саламандр и сатДНК лацер-тидных ящериц (16,15, 17 обзор Capriglione, 2000; Гречко и соавт., 1998; Ciobanu et al., 2003), В частности группой Гречко Б.В. был предпринят таксонопринтный анализ повторяющейся ДНК нескольких родов сем. Lacertidae (15 Гречко и соавт., 1998). Полученные авторами результаты одними из первых указали на филогенетическую значимость повторяющейся ДНК для этого семейства животных и стали основой для дальнейшего изучения эволюции и структуры сатДНК лацертид..
В диссертационной работе эти представления развиты и продолжены при исследовании структуры и эволюции сатДНК практически всех видов p. Darevskia. Комплексный анализ результатов позволил подойти к важным, на наш взгляд, выводам о корреляции молекулярной и морфологической эволюции на видовом и родовом уровне конкретного и весьма слабо изученного таксона позвоночных.
В настоящем обзоре основное внимание уделено рассмотрению литературы, посвященной изучению структурных свойств и возможных путей молекулярной эволюции тандемных повторов ДНК животных, поскольку полученные нами экспериментальные данные и их анализ являются частью этой проблемы. Исследованные в этой работе сатДНК рептилий огр. Sauria, сем. Lacertidae, открыты в нашей лаборатории (15 Гречко и соавт., 1998) и до сих пор с этих позиций не изучались. Таким образом, представляет особый интерес сопоставить наши выводы с имеющимися данными по другим таксонам эукариот.
Мы уделяем внимание также литературе посвященной изучению возникновения и эволюции однополых популяций, зачастую претерпевющих сетчатый путь развития. Для нас эта проблема представляет интерес отчасти потому, что среди двуполых видов p. Darevskia были обнаружены семь партеногенетических (однополых) видов, предположительно возникших в результате гибридизации некоторых двуполых этого рода (см. обзор в статье 18 Чобану и соавт., 2002). Полученные в данной работе результаты могут рассматриваться в пользу гипотезы о гибридогенном происхождении этих партеновидов.
Кроме этой литературы, рассмотрены работы, затрагивающие проблему значения использования сатДНК в качестве молекулярных маркеров общей эволюции и видообразования у эукариот, поскольку наши данные, на наш взгляд, вносят существенный вклад в ее рассмотрение. Возможность использования сатДНК в качестве молекулярного маркера для изучения филогенетического родства близкородственных видов стала очевидной по мере накопления данных, свидетельствующих о том, что темпы эволюции повторяющейся ДНК пропорциональны темпам дивергенции видов (16, 9 Capnglione, 2000; Гречко, 2002). В связи с этим представлена краткая характеристика исследуемых нами таксонов сем. Lacertidae -ящериц p. Darevskia и Lacerta s. str., что необходимо для понимания приводимого нами сопоставления морфологической и молекулярной филогении этой группы животных.
Особенности структуры сатДНК и их функциональное значение
Анализ структуры кластеров и мономеров тандемных повторов выявляет не абсолютно четкие, но ясно прослеживающиеся закономерности строения сатДНК, позволяющие допустить, что она могла бы играть определенную роль в некоторых молекулярных процесах жизнедеятельности ядра и клетки. При исследовании первичной структуры мономеров некоторых сатДНК обнаруживаются характерные прямые и обратные повторы образующие стабильные крестообразные и диадные (шпилечные) структуры (77, 78 Fowler, Skinner 1985; Bigot et al., 1990). Молекулы ДНК, имеющие такую структуру, характеризуются замедленной миграцией в полиакршгамидных гелях по сравнению с линейной ДНК того же размера (79 Diekmann, Lilley 1987). Такие структуры могли бы участвовать в опосредованной регуляторной деятельности генома, путем воздействия на компактизацию хроматина или связывание с белками (78, 80, 81 Bigot et al., 1990; Benfante et al, 1990; Guieysse et al., 1997). Сателлитные последовательности имеют также возможность образовывать структуры высших порядков, обусловленные кривизной ДНК-спирали (40, 82 Ugarkovic et ah, 1992; Plohl et al., 1998). Они могут быть выявлены также с помощью миграции в полиакриламидном геле или при помощи электронной микроскопии и компьютерного моделирования (83 ЕсЫаЫ, Anderson, 1987). Югославские ученые, рассматривая последовательности сателлитов жуков Tenebrio molitor и Т. obscurus, с одной стороны, и Palorus ratzenbergii, с другой, различные по первичной структуре, но сходные по третичной, выдвигают идею, что отбор может касаться именно высших структур сатДНК (82 Plohl et al, 1998). Необычная кривизна ДНК-спирали, как полагают, играет роль в позиционировании частиц нуклеосомного кора и в образовании компактного сателлитного ге-терохроматина (84а- 86 Radic et al, 1987; Martinez-Balbas 1990; Canapa, 2002), а также в связывании определенных белков (80, 87, 846, 88, Benfante etal, 1990; Yamada et al, 1990; Radic et al, 1992; Hibino et al, 1993). He исключена специальная роль альфоидной ДНК в компактизации нуклеосом центромерных участков (89 Warburton, 1993). Об этом свидетельствуют, например, данные (90 Larin et al, 1994), показавшие, что конструкции YAC, содержащие альфоидную ДНК центромерных районов, при их введении в клетки человека или хомячка образуют структуры, обладающие свойствами центромер - цитогенетически видимой конструкции, разрушающейся при вступлении клетки в анафазу и взаимодействующей со специфической антисывороткой к белкам CENP-A, -В и -С. Консервативные блоки, характерные для эволюционно далеких таксонов, протяженностью в несколько нуклеотидов, подобные тетра- и нонануклеотидам мономера (190 п.н.) сателлита птиц и блоку связывания CENP-B белка (17 п.н.), могут быть альтернативой сложным структурам для связывания специфических белков (91, 92, 89, 93 95 Masumoto et al, 1989; Madsen 1994; Warburton et al, 1993; Haaf et al., 1995; Romanova et al, 1996; Kipling, Warburton, 1997).
Наиболее привлекательными на современном этапе остаются представления о структуре сатДНК в связи с ее предполагаемой ролью в компактизации хроматина (84,40,96, 89 Radic et al, 1987; Ugarkovic et al, 1992; Vogt 1992; Canapa, 2002) и в организации таких гетерохроматиновых структур хромосомы, как центромеры и теломеры (97 Eichler, 1999). Так, за исключением точечных центромер дрожжей и голоцентричных хромосом Саепог-habditis elegans (98 Pluta et al., 1995), в центромерах всех изученных видов растений, животных и грибов содержание тандемных повторов исключительно высоко (99 Choo, 1997). Несмотря на то, что детали структуры ДНК центромер различаются у разных видов, основные черты совпадают, а именно в них присутствуют АТ-богатые тандемные повторы, чередующиеся с кластерами транспозонов, принадлежащих разным семействам (100 - 103 Round et al„ 1997; Dong et al., 1998; Cambareri et al., 1998; Sun et a!., 1997; 2003).
Помимо консервативных блоков, внутренних повторов, определящих специфичность организации нуклеотидных последовательностей, размер мономера может также быть структурно-функциональным важным признаком (104 Matyasek et al., 1996). К примеру, при изучении свойств ДНК в качестве полиэлектролита было обнаружено, что некоторые регулярно повторяющиеся последовательности длиной -150 - 200 п.п. обладают прочным естественным изгибом, принимая кольцевые и сверхспирализованные формы (105 Olson, 1996). Подобные изгибы имеют значение для компактизации ДНК в узких пределах ядра, а также для биологических процессов, основанных на узнавании и/или на длительных взаимодействиях. Было отмечено, что присутствие связанных белков, подобно ги стонам в нуклеосомах или разнообразным факторам транскрипции, влияет на форму длинных молекул ДНК. Так, с помощью моделирования показано, что воздействие некоторых белков можно имитировать изогнутой ДНК-вставкой (105 Olson, 1996). В некоторых семействах сатДНК обнаружено, что степень метилирования CG-нуклеотидов понижена и это может влиять на уровень хромосомных перестроек и приводить к разным функционально-патологическим явлениям, в частности, таким как рак (106 обзор Dunn, 2003).
Сетчатая эволюция. Ее значение для видообразования в животном царстве
В настоящей работе приведены результаты исследования с помощью сатДНК достаточно частного и представляющего для нас особый интерес вопроса о происхождении однополых (партеногенетических) популяций изучаемого нами таксона рептилий. Предполагается, что партеногенетические популяции (виды), в частности, ящериц рода Darevskia, возникли в результате межвидовой гибридизации двуполых видов. Это имеет непосредственное отношение к более общей проблеме значения межвидовой гибридизации в видообразовании и эволюции эукариот (сетчатая эволюция) (159 Arnold, 1997). Гибридогенная гипотеза имеет свою историю развития, кратко рассмотренную далее.
Видообразование, происходящее в результате событий гибридизации, широко известна и активно обсуждется для царства растений (160,161 Palacios et. al., 2000; Lia et. al., 2001). Но вопрос о значении такого способа видообразования в природе остается открытым даже относительно растений (159,162 Arnold, 1997; Fuertes Aguilar J, 1999). В животном царстве сетчатая эволюция, в качестве равнозначной дивергиргентной эволюции, способа видообразования, еще менее признана (159 Arnold, 1997). Это связано, на наш взгляд, с тем, что число работ, свидетельствующих о гибридизационных событиях, приводящих к образованию нового вида, довольно мало. Тем не менее, последние десятилетия существенно пополнили данные о сетчатой эволюции видов царства животных (163-166 Bullini, 1994; Sota, Vogler, 2001; Mateos, Vrijenhoek, 2002; Bulatova et. al., 2002).
Зачастую гибридизация между достаточно отдаленными популяциями или хорошо ус тановленными видами приводит к нарушениям функции репродуктивного аппарата, при чем большая часть жизнеспособных гибридов становятся стерильными (159 Arnold, 1997). Однако некоторые изменения репродуктивного апарата являются функционально-жизнеспособными, приводящими к появлению исключительно или преимущественно женских либо мужских особей (163 Bullini, 1995). Это может осуществляться с помощью следующих механизмов. 1) Партеногенез, когда развитие неоплодотворениых яиц приводит к формированию исключительно женских особей. Это может происходить либо мейо-тическим путем, при котором мейоз происходит, но предварительно удваивается число хромосом, либо амейотическим путем, когда мейоз полностью отсутствует, яйцеклетки делятся только митотически. 2) Гиногенез, когда развитие совершается после активирования яиц с помощью сперматозоидов близкородственного вида, но оплодотворение не происходит, и развиваются исключительно женские особи. 3) Андрогенез, когда развиваются исключительно мужские особи в результате слияния двух сперматозоидных ядер в ово-плазме, ядро яйца при этом полностью удаляется (167, 168 Mantovani, Scali 1992; обзор Grebelnyi, 2000). 4) Гибридогенез Шульца (кредитогенез), когда происходит оплодотворе-ние и потомство (женские и мужские или только женские особи) наследует признаки обоих родителей. Однако в этом случае следующему поколению геном отца не передается, будучи отброшенным, и последующее потомство размножается клонально, сохраняя способность востанавливать гибридное состояние при новом скрещивании. 4) Двуполое, когда происходит оплодотворение яиц сперматозоидами самцов другого вида. Примером является хорошо установленный гибридный двуполый вид рыб - Gilla seminuda (163,168 обзоры Buliini, 1994; Grebelnyi, 2000). Наиболее обширная база данных создана для однополых видов позвоночных, пре имущественно гибридного происхождения (169 Vrijenhoek et. al. 1989). Таксономия и ви довой статус таких видов широко обсуждаются в работе М. Арнольда (159 Arnold, 1997). Автор приходит к выводу о несомненом видовом статусе гибридных однополых биоти пов, в частности, на основании их генетической изолированости от родственных двупо лых видов, признавая их отдельными таксонами, соотносимыми с двуполыми видами. В ряде случаев, молекулярные маркеры, вкупе с цитогенетическими исследованиями, оказа лись высокоинформативны для выявления механизма видообразования и родительских форм этих однополых биотипов (169-191). В основном, все известные до сих пор однопо лые таксоны среди позвоночных (169, 170 Vrijenhoek et. al, 1989; Даревский, 1993), также как и насекомых (167,171 Mantovani, Scali 1992; Normark, Lanteri, 1998) и некоторых мол люсков (172 Komaru et al., 1998, 99), возникли в результате гибридизации родственных двуполых видов. Более необычный механизм однополого размножения был недавно опи сан у ряда насекомых, у которых женские клоны возникают в результате воздействия внутриклеточной бактерии путем превращения гаплоидных самцов в самки (173, 174 Zchori-Fem et al., 2001; Perrot, 2002). Подобные формы однополого размножения эволюционируют не сетчатым образом, не задействуя межвидовую гибридизацию.
Клонирование мономеров сатДНК в плазмидном векторе.
Плазмиды несущие вставки трансформировали, используя штамм XL-lBlue клеток Escherichia colt. Трасформацию Е. colt с помощью ДНК рекомбинантных плазмид проводили согласно следующему протоколу (218 Sambrook et al., 1989). 1) Бактериальную культуру Е, coli штамма XL-1 Blue рассевали штрихом на чашку Петри с 1,5%-ной агаризован-ной средой LB и инкубировали в течение ночи при 37С. Индивидуальную колонию помещали в 5-10 мл жидкой среды LB и инкубировали в течение ночи на шейкере при 37С. 2 мл ночной культуры вносили в колбу с 40 мл LB и инкубировали 1-2 ч на шейкере при 37С до оптической плотности 0,3 при 550 нм. Помещали культуру в лед. Центрифугировали при 7 тыс. об/мин. 2 мин. в стерильных центрифужных пробирках. Супернатант отбирали и добавляли половину объема стерильного охлажденного раствора СаСЬ, ресус-пендировали и инкубировали во льду 20 мин, Центрифугировали 2 мин. при 7 тыс. об/мин. и снова ресуспендировали в 1/10 начального объема холодного СаСЬ. В стерильные пробирки типа "эппендорф" вносили 200 мкл суспензии, добавляли 20 мкл стерильного глицерина и хранили компетентные клетки при -70С. 2) 200 мкл компетентных клеток в 1.5 мл пробирке инкубировали во льду 5-10 мин. Добавляли 0.1-0.2 мкг ДНК плазмиды несущей вставку и инкубировали во льду 40 -60 мин. Инкубировали 1,5 мни при 42С в водяной бане, затем помещали на 5 мин в лед. Добавляли до 1 мл среды LB и инкубировали при 37С в течение 1 ч. Рассевали на чашки Петри с 1,5%-ной агаризованной средой LB, содержащей ампициллин в концентрации 50 мг/мл, 1 мМ X-gal и 1 мМ IPTG и инкубировали в течение ночи при 37С. Колонии Е. coli (штам XL-1), несущие плазмиды со вставками, отбирали, основываясь на их цвете (р-галактозидазный тест) (белые), при росте на селективном LB-arape с IPTG и X-gal. Плазм иды со вставками выделяли по стандартной методике (219 Lee and Rasheed, 1990). Индивидуальную колонию помещали в 2 мл жидкой питательной среды ТВ и инкубировали в течение ночи на шейкере при 37С. 2 мл ночной культуры OD - 0,6-0.7 осаждали центрифугированием 5 мин. при 12.5 тыс. об/мин (пробирки типа«Эппендорф»), Супернатант сливали, осадок ресуспендировали в 200 мкл лизируюшего буфера, содержащего 50 мМ глюкозы, 25 мМ трисНО, 10 мМ ЭДТА, рН = 8,0. Ресуспендировали и инкубировали 5 -20 мин. при комнатной температуре. Добавляли 400 мкл свежеприготовленого раствора, содержащего 0.2 N NaOH, 1% ДСН, осторожно перемешивали, инкубировали во льду в течение 5 мин. Добавляли 300 мкл ледяного 7.5 М ацетата аммония (рН 7.6), перемешивали 10с, переворачивая пробирку, инкубировали во льду в течение 5 мин. Центрифугировали 10 мин. при 12 тыс. об/мин. Супернатант переносили в чистую пробирку, еще раз центрифугировали, опять переносили. К супернатанту добавляли 0.6 объема изопро-панола, перемешивали и инкубировали 10 -20 мин. при комн. температуре, центрифугировали 15 мин. при 12.5 тыс. об/мин. Супернатант сливали, осадок инкубировали в 100 мкл ледяного 2М ацетата аммония (рН 7.4) во льду в течение 5 мин и ресуспендировали. Центрифугировали 15 мин при 12.5 тыс. об/мин. К супернатанту добавляли 100 мкл изопро-панола, перемешивали и инкубировали 10 -20 мин при комнатной температуре, центрифугировали 15 мин. при 12.5 тыс. об/мин. Осадок промывали 70% этанолом, центрифугировали 15 мин. при 12.5 тыс. об/мин., высушивали и растворяли в деионизоваиной воде.
Секвенирование одноцепочечных матриц по методу Сэнгера проводили по протоколу и с использованием набора реагентов фирмы "Promega" и "СилексМ" (Москва). При использовании реагентов фирмы "Силекс М" был разработан наш протокол для секвенирования тандемно повторяющейся ДНК длиной 50 - 300 п.н. Гибридизационный анализ проводили с помощью Саузерн- и дот-гибридизации. Концентрацию ДНК для каждой пробы определяли, используя в качестве контроля стандартную ДНК с известной концентрацией (геномная ДНК мыши, человека).
Гибридизационые зонды сатДНК готовили, используя ПЦР, специфичные праймсры и ранее полученные нами плазмидные конструкции, включающие мономер определенного типа сатДНК. Матрицу очищали от примесей возможных других продуктов ПЦР с помощью фракционирования в агарозном геле. Мечение проводили также с помощью ПЦР, специфичных праймеров и [a- 32P]dATP. Для CLsatI и CLsatll частично использовали праймеры и матрицу разработанные И.А. Рудых (147 1999); впоследствии для CLsatll использовали прямой праймер
Для саузерн-гибридизации, геномную ДНК каждого иследуемого вида подвергали исчерпывающему гидролизу эндонуклеазами HindUl либо 7із І ("Fermentas", Литва). После разделения фракций в 1.5% агарозном геле, ДНК переносили на нейлоновую мембрану HybondN (Amersham), следуя рекомендациям производителя.
Для дот-гибридизации, нерасщепленную геномную ДНК каждого иследуемого вида ящериц переносили на мембрану HybondN +). Перенос и гибридизацию проводили, следуя протоколу производителей HybondN + («Amersham»). Количественно оценивали интенсивность сигнала гибридизации с помощью радиосканнера Phosphoimager и программы OptiQuant, прилагающейся к нему. Число копий повторов в гаплоидном геноме изученных организмов определяли на основании данных, полученных при помощи точного считывания сигнала гибридизации радиосканнером Phosphoimager. Расчеты производили на основании раститрованной ДНК плазмиды со специфичной вставкой сателлитного (под)семейства и раститрованной геномной ДНК. В качестве реперной величины гаплоидного генома ящериц родов Darevskia и Lacerta s. str. использовали данные по видам L. agilis {1.6 - 2.1 pg) и L. viridis (1.6- 2.5 pg) единого международного банка данных wwvv.penomesize.com/reptiles.htm, по другим видам этой группы рептилий или близким видам данные не были обнаружены, В качестве основных величин использовали расчеты: 1 мкг копий pUC19 (2686 п.н.) = 3.4 х 10й копий; lpg= 10бт.п.н.
Молекулярные механизмы, участвующие в эволюции семейства CLsat
Механизмы возникновения и эволюции сатДНК неоднократно обсуждались в литературе. Предполагается на основе анализа структуры, что скользящая репликация и дупликации коротких фрагментов задействованы при возникновении повторов, а также в процессе их дивергенции. Как правило, выявляются подструктуры и надструктуры, характерные для организации тандемных семейств. Зачастую ныне фиксированная повторяющая единица состоит из субъединиц в разной степени вырожденных, коровую последовательность которых, чаще всего, составляют гомополимерные треки (119,113,114 Horz and Alenburger 1981; Stephan 1989; 1994). Наличие коротких гомополимерных треков, наряду с более длинными, в разной степени деградированными, внутренними повторами мономеров CLsat может свидетельствовать о первоначальной роли скользящей репликации в возникновении этого семейства сатДНК (рис. 4, 5). К примеру, представляется весьма вероятным участие скользящей репликации в возникновении и дивергенции таких вариантов повтора CLsatHI, как der31 и der32 (рис. 8). Более высокий уровень дивергенции более длинных внутренних повторов свидетельствует о том, что процессы однонуклеотидных замен, инсерции, делеций играют значительную роль в дивергенции и эволюции повторяющихся единиц CLsat-семейства. Эти изменения, случайно возникающие на протяжении мономера, в дальнейшем благодаря механизмам гомогенизации фиксируются в виде новых вариантов повтора, образуя подсемейства существующего семейства.
Это хорошо согласуется с моделью концертной эволюции, предполагающей динамическое взаимодействие нескольких молекулярных механизмов в процессе эволюции тандемных повторов ДНК (107, 228 Dover et. al., 1982; Dover, 1982). Основные рассматриваемые этой моделью механизмы - это скользящая репликация, однонуклеотидные замены, генная конверсия и кроссинговер. Предполагается, что направляющая роль эволюционного вектора определяется частотой воздействия каждого молекулярного механизма, а также соотношением этих частот. Повышенный темп накопления мутаций и низкий уровень гомогенизации приводят к повышению внутривидовой вариабельности и к снижению видоспецифичности повторов. Повышенный темп накопления мутаций совместно с высокой частотой генной конверсии и амплификации могут привести к «замене» одного варианта повтора на другой. Более детальный анализ мономеров CLsat с помощью моделей Смита (117 Smith 1976) и Стефана (113 Stephan 1989) свидетельствует в пользу представления о взаимодействии нескольких молекулярных механизмов в эволюции этого сателлитного семейства. Из модели Стефана следует, что формирование более длинных повторяющихся единиц пропорционально снижению частоты рекомбинационных событий. В свете этой модели, структура мономера семейства CLsat отвечает представлению о крайне низких величинах частот рекомбинационных процессов, что, в свою очередь, согласуется с гетерохроматиновой локализацией повторов этого класса ДНК (гетерохроматин практически не участвует в рекомбинациях). Соотношение длины и уровня дивергенции существующего ряда внутренних повторов CLsat свидетельствует в пользу мнения о преобладающем значении событий скользящей репликации и накопления однонуклеотидных замен над событиями рекомбинации.
Вероятно, по какой-то причине события неравного кроссинговера блокируются, несмотря на то, что как отмечено при изучении млекопитающих, для успешной рекомбинации достаточно участка в 25 п.н. со 100% сходством (229 Ayares et al., 1986), по другим -даже меньше-5 п.н, (230,63 Rubnitzand Subramani 1984; John and Miklos 1979). . Жирным шрифтом выделены участки, задействованные в процессе скользящей репликации. Строчными буквами указана вновь синтезированная цепь, звездочками указаны мутации, произошедшие после синтеза цепи. а. Мономер ros3. Стрелками обозначены две пары 1-1 и 2-2 прямых повторов, фланкирующие амплифицированный участок в мономере предшественника, являющиеся комплементарными между собой. Вероятно, именно они стали точками mis-pairing, б. МоЕюмеры der31. der32. Линии над последовательностями der31, der32 маркируют три коротких прямых повтора, также фланкирующих амплифицированный участок. Стрелками с двойными концами указаны два зеркальных повтора, способных приводить к образованию петли в зоне дуплицированного участка. Стефан (113 1989) обнаружил, что длина гомополимерных трактов, встречаемых в составе субъединиц повторов, никогда не превышает длину гомологичной последовательности, необходимой для рекомбинации. Мономер CLsat изобилует подобными гомополи-мерными трактами, и, в принципе, мог бы участвовать в рекомбинации. Таким образом, снижение частоты рекомбинации мономеров CLsat может быть связано либо с их локализацией в зонах, препятствующих этому событию, таких как перицентромерный, цеитро-мерный ителомерный гетерохроматин, либо является следствием высокого темпа накопления мутаций, что не исключает одновременного воздействия этих факторов.
