Введение к работе
Актуальность проблемы
Бактериальные Еирусы явились основными модельными .объектами, которые определили успешное развитое многих направлений молекулярной биологии. Исключительно важную роль бактериофаги сыграли при изучении структурно - функциональной организации биомакромолекул и механизмов сборки надмолекулярных биологических комплексов и вирусов. Интерес к бактериофагам в последнее время объясняется перспективами репения с их помощью не только фундаментальных, но и прикладній проблей. В частности, механизм упаковки ДНК Т-четных бактериофагов и вирусов семейства Herpssvirldae весьма схожи (Kaliiiski, Black, 1S06; Booy. et.al. 1992). Кроме того, как у бактериофагов Т-четной серии, так и у представителей Herpesvlrlda? процесе формирования капсида основан на сборке промежуточного бежевого ядра, которое подзергается полному прогеолитичеекому расщеплению на поздних стадиях формирования вирионов (Welch, et.al., 1991). Недавно обнаружено, чте протеиназа, кодируемая геном 21 бактериофага ТА, и протеиназа Herpssvirldae теп? значительную гомологию. Процессы упаковки ДНЕ л высокослецифичесшго протео-лиза белесвого ядра могут яеиться весьма удобныая мишенями для создания hcjshz хижстерапевтическях оргдеиз. К моменту начала этой работа нуклеотидная последовательность гёяа 20, кодирующего белок, ответственным за инкниащзо образования кора к упаковку ДНК вируса, а также последовательность гена 22, кодирующего главный компонент ядра сборки прокатила, не были известны, их клонирование, определение полной нуклеотидвой последо-сательносїи, экспрессия в клетют Е. coli, а также сравнительное изучение региона генов', форквдгадих ядро и ьротеиназу, кодируемую геном 21 у фагов, родственных Т4, и явилось основой данной диссертационной работы. Ш. рассматриваем наши данные в свете последущих исследований Т-четных бактериофагов и Horpesviridae с целью получения высокоспецифичяьЕ лигандов для хкмяотерааки вирусных инфекций ДЕК-содержащих гирусов на стадии упаковки ДНЗч в прокапсид и ингкбировзякя лротеиназ.
Научная новизна
В кастояшей работе впервые были проклонирогакы и определены полные нуклеотидные последовательности ДНК генов 20 и 22, кодируюиих белки ядра сборки прокалсида бактериофага Т4, кото-
рая составляет, соответственно, 1572 и 307 куклеотидных пар.
Впе«ЕЫ? проведено физическое картирование гєное, кодирующих прокзясэдные белки бактериофага 72 и получека кдонотека генома этого фага. Ероюширована и определена полная нуклео-тидная последовательность генов 67, 68 и 21, а также проклони-рована и частично определена последовательность генов 0 я 22, кодирующих белки сборки прокапсида фага Т2.
Создан вектор экспрессии гена 22 бактериофага Т4, позволяющий нарабатывать этот белок в препаративных количествах.
Методом полиыеразной цепной реакции впервые получен для 32-х бактериофагов, родственных Т4, фрагмент гена 21, кодирующий вирусную протеилазу.
Направленность и ценность работы
При выпшшевии диссертационной работа ш в ссповноы преследовали цели фундаментального характера „- получение новых сведений о последовательности генов бактериофага Т4, играющих ключевую роль в формировании прокапсида. Несомненно, результаты определения нуклеотидной последовательности генов 20 и 22 бактериофага Т4 и больаинства генов, кодирующих белки ядра прокапсида бактериофага дикого типа Т2, родственного фагу 74, являются базовыми для дальнейших генетических и биохимических исследований, а также для изучения структуры белков, кодируемых этими генами.
Важно отметить, что объектом исследования явились структурные белки кора проголовки фагов, родственных фагу Т4. Поскольку, как известно, размер и форма капеида этих сложных вирусов определяются лроголоБКой, то результаты диссертации важны для понимания формообразования сложных надмолекулярных биологических структур и ЛНК - содержащих зирусов.
изучение Бирусспецифической прртеиназной активности может иметь практическое значение з медицинской практике при создании ингибиторов вирусного созревания (Шрнов, 1989). Поскольку протеиназа бактериофага 74 - Т4 РРаза имеет родство и гомологию с протеивазой вирусов семейства Herpesvlrldas; то дальнейшее изучение этого белка приобретает особо актуальное значение.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Клонирование.и определение нуклеотидной последовательности гена 20, контролирующего инициацию формирования ядра сборки прокапсида бактериофага Т4 и упаковку ДНК вируса.
-
Клонирование и определение нуклеотидной последовательности гена 22. ответственного за синтез главного компонента
ядра прскзпсияа.
3. Модель регуляции полимеризации продукта гена 22 пси формировании ядра сборки лрокалсида.
Апробация работы
Результаты исследований были доложены на заседании Специ- авизированного апрооационного совета " Общая и молекулярная вирусология " при НЮ! вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН 27. 01. 1993 года.
Публикации
Материзлк диссертации изложены в 4. научных статьях. Нук-деотидные последовательности ЛЕК генов 20 и 22 бактериофага Т4 депонированы в ЕШЬ GENBANK.
Объем и структура работы
Диссертация построена по класоэтескому шалу л состоит, из зведення, обзора научной литературы по теме диссертационной работы, методической части, результатов исследования и их обсуждения', заканчивается выводил; результатов исследовательской работы и списком цитируемой литературы. Объем диссертационной работы составляет 126 страниц машинописного текста. Полученные результаты иллюстрированы 5 таблицами и 22 рисунками. Список цитируемой литературы включает 155 наименовании.