Введение к работе
Актуальность проблемы и общая характеристика работы.
Хроматин, носитель генетической информации всех живых клеток, представляющий собой динамичный комплекс нуклеиновых кислот и белков, с глубокой структурной иерархией, является одним из основных компонентов всех эукариотических ядер. Структурные исследования хроматина значительно продвинулись вперед за последние полтора десятилетия. Открытие в 1973 году нуклеосом -фундаментальных субъединиц хроматина, содержащих ДНК длиной от 160 до 240 пар нуклеотидов (п.н.), одну молекулу гистона HI (или его аналога) и по две молекулы каждого из четырех гистонов Н2А, Н2В, НЗ и Н4, стимулировало лавинообразное количество исследований первых двух уровней упаковки ДНК в ядрах - нуклеосом и 30-нм фибрилл. Используя сведения, полученные методами рентгеноструктурного анализа, белок-белковых сшивок и определения первичной организации ДНК-белковых комплексов (распределение контактов белков вдоль нити ДНК), были созданы структурная модель нуклеосомного кора (в русской литературе синонимом является термин "минимальная нуклеосома"), представляющего собой комплекс четырех пар гистонов кора и ДНК длиной 145 п.н. (Richmond et al. 1984) и модель его белковой основы - октамера гистонов (Arents et al. 1991). За последние пятнадцать лет было предложено также около двух десятков моделей 30-нм фибриллы - второго уровня упаковки ДНК в ядрах. Однако, в отличие от модели нуклеосомного кора, ни одна из предложенных моделей не может рассматриваться как доказанная. Вместе с тем, даже эти относительно хорошо в структурном отношении изученные компоненты хроматина до настоящего времени в значительной степени продолжают напоминать китайскую головоломку -их внутреннее устройство и способность к пространственным преобразованиям остается для нас скрытой. Кроме того, в последнее время произошла значительная переориентация структурных исследований хроматина на их функциональные аспекты. На первый план вышли такие вопросы как конформационные изменения нуклеосом и 30-нм фибрилл при транскрипции и репликации, наличие и расположение нуклеосом в функционально значимых участках ДНК, их взаимодействие с регуляторними белками и влияние различных уровней организации хроматина на процессы матричного синтеза (Wolffe, 1990; Grunstein, 1990).
Цель и задачи исследования,
Основной целью данной работы было разностороннее изучение сходств и различий структуры, конформационных возможностей v изменений первых двух уровней организации хроматина (нуклеосом ч 30-нм фибрилл), находящихся в разных конформационных состояниях н составе модельных систем или в разных функциональных состояниях і ядрах клеток эукариот. Необходимо было выяснить до какой степені структура нуклеосом и 30-нм фибрилл является универсальной для представителей далеких таксономических единиц эукариот и какук роль в их организации играют варианты гистонов. С другой стороны, необходимо было решить вопрос о том, насколько сильно различается структура нуклеосом транскрипционно или репликационно активных v репрессированных ядер. Кроме того, в работе ставилась задаче изучения нуклеосом в плане возможных изменений их структуры і процессах матричного синтеза. Необходимо было также разобраться і деталях организации 30-нм фибриллы и постараться обьясниті ме-ханизмы ее структурно-функциональных изменений.
Научная новизна и практическая ценность работы.
В основу работы положен оригинальный метод изучени? ДНК-белковых взаимодействий в составе хроматина с помощьк индуцируемых диметилсульфатом (ДМС) ДНК-гистоновых сшивок, приоритет разработки которого принадлежит диссертанту и егс соавторам. С помощью этого метода - определения первичноі организации ДНК-белковых комплексов - с большой точностью бьші локализованы контакты всех пяти гистонов с ДНК в составе нуклеосоїі относительно 5'-конца нуклеосомной ДНК. С помощью этого метод* впервые были получены прямые данные, подтвердившие выдвинутуи ранее на основе косвенных результатов гипотезу, об универсальное строения нуклеосомного кора всех трех высших царств зукариоі (Животные, Растения и Грибы) и была предложена модель автономно^ расположения контактов тетрамера гистонов (НЗ,Н4)2 и двух димерої (Н2А,Н2В) на ДНК нуклеосомного кора. Кроме того, впервые былс показано, что полная инактивация хроматина не сказываете; существенным образом на первичной организации нуклеосомного кора.
Применение данного метода позволило изучить тонкие изменени; ДНК-гистоновых контактов в модельных экспериментах по исследованш структуры нуклеосом в растворах с различной ионной силой. ]
минимальных нуклеосомах был обнаружен ряд конформационных переходов и впервые показано, что взаимодействие отдельных участков гистонов с ДНК может быть нарушено без заметного изменения структуры нуклеосомного кора в других его областях. Важным моментом является то, что ряд структурных изменений, обнаруженных в модельных экспериментах, был зарегестрирован и в составе хроматина, где соответствующие конформационные переходы наблюдались, в частности, при декомпактизации 30-нм фибриллы. Кроме того, был предложен механизм стабилизации частиц, образующихся из нуклеосомного кора в результате диссоциации из него гистонов Н2А и Н2В.
Методом определения первичной организации иуклеосом было выявлено перераспределение гистона HI во время процессов конденсации-деконденсации 30-нм фибриллы хроматина. В сочетании с нуклеазными тестами, этот метод позволил показать, что межнуклеосомная ДНК в компактизованном хроматине суперспирализована. В результате диссертантом была предложена оригинальная модель процессов, происходящих во время конденсации 30-нм фибриллы.
Апробация работы.
Представленные в диссертации результаты были доложены на различных Всесоюзных и Международных симпозиумах и конференциях, в том числе: на 47-ом симпозиуме по структуре хроматина (Колд Спринг Харбор, США, 1982); 14-ом Международном конгрессе по биохимии (Прага, Чехословакия, 1988); конференции "Структура хромосомы и экспрессия" (Колд Спринг Харбор, США, 1985); 4-ом и 5-ом двусторонних симпозиумах СССР-ФРГ "Структура и транскрипция генома" (Ереван 1981; Кельн, ФРГ, 1983); 6-м и 8-ом двусторонних симпозиумах СССР-Франция "Структура и функция белков и нуклеиновых кислот" (Цхалтубо, 1982; Москва, 1986); 7-ом Всесоюзном симпозиуме "Структура и функция клеточного ядра" (Пущино, 1984); 16-ой конференции ФЕБО (Москва, 1984); 5-ом симпозиуме "Структура и фукнкция хроматина " (Варна, Болгария, 1984); 5-ом Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986).
Структура работы.